Автореферат: Структурно-функциональные свойства эритроцитарных мембран при дислипопротеинемиях

Примечание. Здесь, и в табл. 3: p₁ - уровень значимости различий по сравнению со значениями у здоровых доноров; p₂ - уровень значимости различий по сравнению со значениями у пациентов сахарным диабетом типа 1. ЛПНП - липопротеины низкой плотности, ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности, ЛПВП - липопротеины высокой плотности, ХС ЛПВП - холестерин липопротеинов высокой плотности

а) б) в)

Рис. 1. Содержание подфракции 2 липопротеинов высокой плотности (ЛПВП2), холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП), суммарных апобелков липопротеинов высокой плотности (апо ЛПВП) и общего холестерина у больных сахарным диабетом типа 1 в зависимости от длительности сахарного диабета (а), степени компенсации углеводного обмена (б) и степени сосудитых осложнений (в).

Примечания. Здесь, и в рис. 2-3: * p<0,05 по сравнению со значениями здоровых доноров; ** p<0,01 по сравнению со значениями здоровых доноров; *** p<0,001 по сравнению со значениями здоровых доноров.

Анализируя данные изменения основных показателей липидного спектра сыворотки крови у больных сахарным диабетом в соответствии с классификацией D. Fredrikson, нами было отмечено частое развитие ДЛП IIб типа (у 29,4 % больных СД 1 и у 40,6 % больных СД 2) и IIа типа (22,2 % больных СД 1 и 40,6 % больных СД 2); IV тип ДЛП (12,5% больных СД 2) встречался реже. Таким образом, были выделены категории пациентов СД с различными нарушениями липидного обмена с учетом типа и степени их выраженности.

К настоящему времени сформировалось мнение, что при сахарном диабете патология липидного обмена создает основу для дезорганизации структуры и функции мембран эритроцитов [Кондратьева Е.И., 2001; Broncel M. et al., 2005] В этой связи особый интерес представляет выявление общих закономерностей и особенностей модификации мембран эритроцитов у больных сахарным диабетом с различными нарушениями липидного метаболизма.

Рис. 2. Содержание фракций фосфолипидов в мембране эритроцитов у больных сахарным диабетом типа 1 и 2

Как показали хроматографические исследования, изменения относительного содержания фракций мембранных липидов эритроцитов у всех пациентов с сахарным диабетом были практически однонаправленными и характеризовались увеличением доли ХС и его эфиров, снижением содержания ФЛ. При этом среди ФЛ преобладали легкоокисляемые формы (фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитолы) на фоне значительного уменьшения доли ФХ, составляющего основу липидной фазы мембран эритроцитов у здоровых доноров, повышалось содержание лизофосфолипидов (рис. 2.).

Известно, что стабильное соотношение между фракциями фосфолипидов является необходимым условием оптимального функционирования мембраны эритроцита [Черняк Н.Б., 1976; Крепс Е.М., 1982]. Увеличение содержания ФС и ФИ на фоне уменьшения доли ФХ приводит к значительной дезорганизации липидного бислоя, проявляющейся прежде всего нарушением асимметрии мембраны. Выявленное у пациентов с СД повышение содержания лизофосфолипидов может быть связано как с повышением гидролиза ФЛ, так и со снижением активности лизо-фосфолипазы. В литературе есть данные, позволяющие считать, что ЛПВП принимают участие в «регенерации» бислоя, удаляя перекисномодифицированные остатки ФЛ, тем самым участвуя в восстановлении липидной фазы [Климов А.Н. и соавт., 2001]. Таким образом, недостаточность ЛПВП способствует усугублению дегенеративных процессов, протекающих в мембране. У пациентов с СД 2 наибольшее повышение содержания лизофосфолипидов в мембранах красных клеток крови было отмечено у больных с сопутствующим ожирением и оказалось равным 12,5 (6,0-20,0) %.

Полагают, что деградация фосфолипидного остова является одной из причин повышения содержания ХС в мембране эритроцитов при патологии. В результате повышенной активности фосфолиполиза и свободно-радикального окисления происходит разрушение фосфолипидных молекул, вследствие чего уменьшается их содержание в мембране, замещаясь на молекулы ХС [Болдырев А.А., 1990, 2006] . При дислипопротеинемиях наибольшее значение приобретает нарушение взаимодействия липопротеинов и плазмалеммы. В кровотоке постоянно происходит обмен липидными компонентами между мембраной эритроцитов и плазменными липопротеинами, причем ХС переходит в мембрану от ЛПОНП и ЛПНП, откуда возможно его включение в состав ЛПВП. Тем самым формируется равновесная система липопротеинов и плазмалеммы красных кровяных клеток, участвующая в регуляции структурного состояния последней [Bruckdorfer K.R., 1967; Quarford S.H., Hilderman H.L. 1970; Hollan S. et al., 1995, 1996; Broncel M. et al., 2005]. Изменение соотношения липопротеиновых комплексов приводит к нарушению равновесия миграции ХС, при этом значительное превалирование количества липопротеинов атерогенных классов над содержанием ЛПВП создают условия для преимущественного поступления ХС в мембраны эритроцитов.

По данным нашего исследования у пациентов с сахарным диабетом повышение содержания ХС в мембранах эритроцитов было достоверно значимым; причем степень увеличения доли ХС в мембранах не различалась у больных СД 1 и СД 2 (рис. 3.). Следует отметить, что у этих пациентов выявлялось увеличение значений индекса атерогенности и отношения ХС/ФЛ в сыворотке крови. Тем не менее обращало на себя внимание, что значительное повышение доли ХС в мембранах эритроцитов у пациентов с СД 1 не коррелировало с какими-либо особенностями клинического течения заболевания. Однако у больных СД 2 было отмечено увеличение доли эстерифицированного ХС по сравнению с его содержанием у пациентов СД 1 и здоровых доноров. Как известно, эстерификация ХС - один из способов его модификации, способствующий последующей акцепции ЛПВП [Болдырев А.А., 1990]. Поэтому накопление эфиров ХС в мембранах эритроцитов у больных с наибольшими значениями концентрации сывороточного ХС свидетельствует о недостаточной функции ЛПВП.

Считается, что увеличение доли ХС неблагоприятно сказывается на динамических свойствах липидов мембраны, так как благодаря своему влиянию на подвижность жирнокислотных хвостов липидного окружения, он способствует повышению микровязкости мембраны. Накопление холестерина в бислое может приводить к ингибированию пероксидации структурированных липидов за счет ограничения молекулярной подвижности жирнокислотных остатков фосфолипидного бислоя. В этом случае ХС выступает в роли структурного антиоксиданта и делает фосфолипидные молекулы более устойчивыми к действию свободных радикалов, которые в свою очередь способны разрыхлять мембранные образования [Горбунов Н.В., 1993; Клебанов Г.И., 1998]. Поэтому поддержание необходимой жесткости мембраны холестерином подчас рассматривается как адаптивная реакция в условиях развития ряда патологических процессов.

Таблица 3

Результаты флуоресцентного зондирования флуорофором пирен и исследования активности Nа⁺,K⁺- ATФазы в мембранах эритроцитов у больных сахарным диабетом типа 1 и 2, Me(Q₁-Q₃)

Наряду с этим динамические свойства липидов, входящих в состав бислоя, определяются большим количеством факторов, среди которых имеют значение степень насыщенности и длина ацильных цепей, состояние и количество белка в мембране, pH и ионная сила [Кагава Я., 1985; Болдырев А.А., 1990]. Для определения роли нарушения липопротеинового обмена в механизмах структурных изменений липидного бислоя мембран эритроцитов нами была проведена оценка их микровязкостных свойств у больных с ДЛП. Результаты наших исследований подтвердили наличие нарушения динамических свойств липидной фазы мембран эритроцитов у больных сахарным диабетом (табл. 3). Так, было установлено достоверное снижение соотношения интенсивностей флуоресценции эксимерных и мономерных молекул пирена (J₄₇₀/J₃₇₀), регистрируемых при длине волны возбуждающего света 340 нм (на 25% по сравнению с нормой), что является отражением возрастания микровязкости липидной фазы мембран. При исследовании структуры мембран эритроцитов у больных СД 1 в области белок-липидных контактов также было выявлено возрастание их микровязкости, на что указывало снижение (на 23% по сравнению с нормой) степени эксимеризации пирена при л_В=285 нм.

В ходе исследования было также показано, что выраженность выявленных изменений микровязкости мембраны зависела от длительности диабета. В частности, параметры флуоресценции зонда пирен у пациентов СД 1 со стажем диабета менее 5 лет значимо не отличались от аналогичных показателей у здоровых доноров (величина коэффициента J₄₇₀/J₃₇₀ при л_В=285 нм составила 0,323 (0,227-0,348) усл. ед., а при л_В=340 нм - 0,371 (0,342-0,417) усл. ед.). Повышение микровязкости мембран эритроцитов у пациентов с более длительным течением СД 1 по сравнению со здоровыми лицами было более выраженным, о чем свидетельствовали значимо более низкие показатели степени эксимеризации пирена как при л_В=285 нм (величина коэффициента J₄₇₀/J₃₇₀ составила 0,248 (0,203-0,293), p<0,01), так и при л_В=340 нм (величина коэффициента J₄₇₀/J₃₇₀ составила 0,321 (0,304-0,376) усл. ед., p<0,01). В группе пациентов с декомпенсацией углеводного обмена было отмечено достоверное увеличение коэффициента J₃₇₀/J₃₉₀ (0,962 (0,960-0,970) усл. ед., p<0,01) при л_в=340 нм, отражающего степень полярности окружения зонда пирен. Изменение других параметров флуоресценции у больных СД 1 с различной компенсацией углеводного обмена имело одинаковую степень выраженности.

Липопротеины, участвуя в регуляции химического состава липидного компонента мембраны, влияют и на её структурные свойства, что подтверждается данными корреляционного анализа. Так, при обследовании больных СД 1 были выявлены корреляционные взаимосвязи между параметрами флуоресценции зонда пирен и показателями липидного спектра сыворотки крови. При этом у больных сахарным диабетом отмечалась положительная корреляция между коэффициентом полярности окружения зонда пирен и содержанием подфракции ЛПОНП₁ (r=0,79, р<0,01). Было также обнаружено, что ЛПВП оказывают благоприятное влияние на величину микровязкости интегрального слоя липидной фазы мембран эритроцитов, на что указывало наличие прямой корреляции между содержанием ЛПВП и коэффициентом эксимеризации пирена при л_в=340 нм (r=0,73, р<0,05).

Весьма интересные результаты были получены при оценке микровязкости липидной фазы мембран эритроцитов у пациентов с СД 2, отличавшихся существенными нарушениями липидного спектра сыворотки крови. Так, у обследованных больных СД 2 медиана значений параметров флуоресценции зонда пирен при взаимодействии с мембраной эритроцитов статистически не отличалась от соответствующего параметра в группе здоровых доноров (табл. 2). Однако анализ полученных данных методом К-средних позволил выявить среди пациентов СД 2 кластеры с разнонаправленными изменениями текучести мембран эритроцитов. Классификация данных проводилась с учетом коэффициента эксимеризации зонда пирен при л_в=340 нм и л_в=285 нм, а также коэффициента полярности J₃₇₀/J₃₉₀. В первый кластер были объединены 36% пациентов со сниженными величинами коэффициентов J₄₇₀/J₃₇₀ при л_в=340 нм (средние значения составили 0,220±0,025 усл. ед.) и л_в=285 нм (средние значения - 0,182±0,014 усл. ед.), а также уменьшенными значениями коэффициента полярности окружения зонда пирен (средние значения - 0,914±0,027 усл. ед.). У пациентов этого кластера было отмечено менее выраженное повышение индекса атерогенности по сравнению с больными других групп (значения составили 4,25 (3,83-5,76)). Особенностью данного кластера пациентов явилось высокое содержание в крови ТГ и ЛПОНП (содержание ТГ составило 248,57 (181,44-269,43) мг/дл, ЛПОНП - (285,68 (116,87-291,95) мг/дл)). ЛПОНП включают много насыщенных жирных кислот, что, вероятно, может обеспечивать дезорганизацию структуры мембран эритроцитов в связи с уплотнением липидных молекул относительно друг друга. При этом важно отметить снижение коэффициента полярности окружения зонда пирен в мембране эритроцитов J₃₇₀/J₃₉₀ (средние значения - 0,914±0,027 усл. ед.) у данной группы пациентов, свидетельствующее об уменьшении количества полярных групп интегральной зоны.

Наряду с этим была выделена группа больных СД 2, у которых мембрана эритроцитов характеризовалась повышенной текучестью и высокой полярностью гидрофобного слоя. У пациентов этой группы были зарегистрированы увеличенные значения J₄₇₀/J₃₇₀ при л_в=340 нм (средние значения - 0,548±0,057 усл. ед.) и при л_в=285 нм (средние значения - 0,574±0,040 усл.ед.). При этом средняя величина коэффициента полярности J₃₇₀/J₃₉₀ оказалась выше, чем у пациентов первого класса (0,955±0,007 усл. ед., p<0,05). В этот кластер были включены 25% больных СД 2 с наибольшими значениями индекса атерогенности (8,73 (5,37-12,30)) и наименьшим содержанием ЛПВП (243,03 (120,64-330,95) мг/дл). Вероятно, гидрофильные продукты ПОЛ в больших количествах, накапливаясь в мембранах при недостаточном содержании в плазме ЛПВП, обладают детергентным действием и способствуют повышению разупорядоченности липидного бислоя [Каган В.Е. и соавт., 1975; Новиков К.Н., 2004]. Это в свою очередь вызывает увеличение подвижности полипептидных цепей интегральных белков в мембране. Высокая полярность группировок (гидроперекисных, гидроксильных, карбонильных), появляющихся в результате индукции ПОЛ в полиеновых “хвостах” фосфолипидов, нарушает гидрофобные белок-липидные взаимодействия в мембране. Таким образом, из-за увеличения степени ненасыщенности, избыточной пероксидации изменяется направленность ацильных остатков.

Показатели микровязкостных свойств мембраны эритроцитов у пациентов третьей группы, в состав которой были включены 39% обследованных пациентов СД 2, соответствовали следующим значениям: средние величины коэффициента J₄₇₀/J₃₇₀ составили 0,434±0,018 усл. ед. при л_в=340 нм и 0,348±0,016 усл. ед. при л_в=285 нм. Выраженность нарушений липидного обмена у этих больных также носила практически промежуточный характер. Таким образом, отмеченное нами разнообразие структурных нарушений мембран эритроцитов, видимо, определяется различными проявлениями воздействия ряда факторов, имеющих влияние на биофизические свойства мембраны. К их числу, на наш взгляд, правомерно отнести нарушения липидного обмена.

При рассмотрении изменений структурных свойств мембран эритроцитов у пациентов с различными типами ДЛП отмечено увеличение микровязкости мембран эритроцитов у больных с повышенным содержанием в сыворотке крови ЛПОНП. Структурные свойства мембран красных кровяных клеток у больных с другими типами ДЛП не различались ни между собой, ни с соответствующими параметрами у здоровых доноров.