Автореферат: Структурно-функциональные свойства эритроцитарных мембран при дислипопротеинемиях

Обследовано 43 больных СД 2 (10 мужчин и 33 женщины) в возрасте от 39 до 60 лет. Длительность диабета у пациентов варьировала от 1 месяца до 21 года, при этом 19 человек страдали СД 2 менее 5 лет, а 24 - более 5 лет. Показатели метаболизма глюкозы указывали на декомпенсированное течение заболевания у всех пациентов с СД 2 (декомпенсацию углеводного обмена у пациентов с СД 2 считали при показателе НbА_1с выше 7,0%). Среди пациентов с СД 2 была выделена группа больных (17 человек), у которых верифицирован диагноз ишемическая болезнь сердца (ИБС). Из них только 2 больных имели нормальный индекс массы тела, 9 человек страдали ожирением 1 степени (индекс массы тела 30,0-34,9 кг/м²), 4 пациента - ожирением 2 степени (35,0-39,9 кг/ м²), 1 человек - ожирением 3 степени. 14 пациентов с СД 2 страдали только ожирением без ИБС, причем у 4 пациентов было отмечено ожирение 1 степени, у 5 больных - 2 степени и у 5 человек - 3 степени.

Таблица 1

Распределение здоровых доноров, больных сахарным диабетом типа 1 и 2, экспериментальных животых на группы в соответствии с использованными методами исследования липидного спектра крови и структурно-функциональных особенностей мембраны эритроцитов

Все пациенты обследованы в момент диспансеризации на фоне проведения коррегирующей углеводный обмен терапии (препараты групп сульфанилмочевины и бигуанидов для больных СД 2 и инсулинотерапия для пациентов с СД 1). Материалом исследования явилась венозная кровь обследованных лиц, взятая утром натощак после шестнадцатичасового воздержания от приема жирной пищи. Для получения плазмы кровь стабилизировали гепарином (25 Ед/мл).

Определение фракционного и субфракционного составов липопротеинов сыворотки крови было проведено с помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния, предложенного Ф.В. Тузиковым и соавт. [1997]. Нами учитывались концентрации липопротеинов 6 основных подклассов (2 субфракции ЛПВП, 2 субфракции ЛПНП и 2 субфракции ЛПОНП) и величина таких интегральных показателей как общий холестерин и общие триацилглицериды. Также были рассчитаны отношение общих фосфолипидов к общему холестерину и индекс атерогенности. Индекс атерогенности рассчитывался как отношение (ОХС-ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП, где ОХС - общий холестерин, а ХС ЛПВП - холестерин липопротеинов высокой плотности. При этом больные с нарушенным липидным обменом были распределены по типу ДЛП по классификации, предложенной D. Fredricson. IIa тип ДЛП регистрировали, если в сыворотке крови значения содержания ХС ЛПНП превышали 175 мг/дл при нормальных величинах концентрации ТГ, IIб тип - если было повышено содержание ХС ЛПНП и ТГ (свыше 175 мг/дл для лиц моложе 40 лет и свыше 210 мг/дл для пациентов 40 лет и старше), IV тип - если значения ХС ЛПНП были в пределах нормы, а концентрация ТГ была повышенной.

Мембраны эритроцитов выделяли путем гипоосмотического гемолиза [Dodge J.T. et al. 1963]. В полученной взвеси мембран определяли микробиуретовым методом содержание белка.

Липиды мембран эритроцитов экстрагировали хлороформ-метаноловой смесью по методу J. Folch et al. [1957]. Общее содержание липидов в мембране эритроцитов определяли методом Н.А. Тарановой [1987]. Препаративное разделение общих липидов проводили методом тонкослойной хроматографии [Финдлей Дж.Б., Эванз У.Г., 1990] в системе растворителей гептан: диэтиловый эфир: этилацетат (в соотношении 80:20:1,5) на пластинках “Sorbfil” (Россия). Разделение фракций фосфолипидов мембран эритроцитов методом тонкослойной хроматографии [Прохорова М.И., 1982] осуществляли в системе хлороформ : метанол : вода (в соотношении 32:12,5:2) на пластинках “Sorbfil”(Россия). Идентификацию фракций липидов осуществляли с использованием соответствующих стандартов (фирма “Sigma”, США). Количественную оценку хроматограмм проводили с помощью разработанной компьютерной программы.

Характеристика структурных свойств липидной фазы мембран эритроцитов проводилась с использованием измерения собственной флуоресценции теней эритроцитов и определения спектральных характеристик взаимодействия мембран с флуоресцентным зондом пирен на спектрофлуориметре “Hitachi-MPF-4” (Япония). Микровязкостные свойства мембраны в области анулярных и общих липидов оценивали по степени эксимеризации пирена, вычисляя отношение интенсивности флуоресценции эксимеров и мономеров (J₄₇₀/J₃₇₀) при длине волны возбуждающего света (в) 285 и 340 нм, соответственно. Полярность окружения молекул пирена оценивали по отношению J₃₇₀/J₃₉₀ при в=340 нм [Добрецов Г.Е., 1989]. Рассчитывали показатель миграции энергии с триптофановых остатков на пирен по формуле, предложенной Ю.А. Владимировым и Г.Е. Добрецовым [1980].

Определение активности Na⁺,K⁺-АТФазы в мембранах эритроцитов определяли методом, разработанным А.М. Казенновым и соавт. [1984] и основанном на накоплении неорганического фосфора (Рi) в среде, содержащей АТФ, в результате его гидролиза под действием АТФазы. Содержание Рi определяли по методу Р.S. Chen et al. [1956].

В рамках диссертационной работы был выполнен экспериментальный блок, связанный с исследованием структурной организации эритроцитарных мембран у крыс в условиях инкубации взвеси теней эритроцитов с липопротеинами основных классов (ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП), а также их апобелками (аполипопротеинами А-I, С и Е) in vitro. Липопротеины выделяли из сыворотки крови крыс с помощью изоплотностного ультрацентрифугирования в растворе KBr [Hatch F.T., Lees R.S., 1968]. Для получения аполипопротеинов проводили делипидирование липопротеинов охлажденной смесью хлороформ-метанол (2:1) с последующей многократной отмывкой эфиром. Фракции, содержащие аполипопротен A-I, С и Е, очищали с помощью ионообменной хроматографии с использованием ионообменника «DEAE-Toyopeare 650 М-TSK» (Япония) [Laemli U.K., 1970]. Инкубацию теней эритроцитов с липопротеинами и их апобелками проводили при 37°С в течение 20 мин с последующим однократным отмыванием и исследованием структурных свойств мембран эритроцитов с помощью флуоресцентного зонда пирен. Параллельно каждой опытной пробе ставилась контрольная проба, содержавшая тени эритроцитов того же животного с инкубационной средой (10 мМ трис-HCl буфер, рН 7.4).

Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с использованием методов статистического анализа. Проверка на нормальность распределения была осуществлена с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для проверки гипотезы о значимости различий законов распределения исследуемых признаков для отдельных групп пациентов был применен критерий Манна-Уитни (U-тест) для несвязанных выборок, для обработки результатов экспериментальных данных - критерий Вилкоксона для попарносвязанных выборок. Для выявления функциональных взаимосвязей между группами изученных параметров использовали вычисление коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Распределение общей группы больных по категориям было осуществлено с помощью кластерного анализа методом К-средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На сегодняшний день имеется немало данных, свидетельствующих о том, что зрелые эритроциты обновляют свой липидный состав благодаря взаимодействию с ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП [Quarford S.H., 1970; Faergeman O., Havel R.J., 1975; Poon R., 1981; Hollan S. et al., 1995, 1996; Broncel M. et al., 2005]. Подтверждением наличия обменных процессов между плазменными липопротеинами и мембраной эритроцитов является и установление факта дезорганизации липидного бислоя красных кровяных клеток у больных с дислипопротеинемиями.

Многочисленные данные литературы говорят о широкой распространенности нарушений липидного обмена у больных сахарным диабета как типа 1, так и типа 2, связанных прежде всего с нарушением гормональной регуляции метаболических процессов [Manzato E. et al., 1989; Hanefeld M., 1994; Деменкова, 2001; Яфасов К.М., Дубянская Н.В., 2001; Потеряева О.Н. и соавт., 2003; Vergиs B., 2005; Lapolla A. et al., 2006]. Согласно данным наших исследований, у больных СД 1 липопротеиновый спектр сыворотки крови характеризовался повышением концентрации общего ХС, изменением субфракционного состава ЛПВП и повышением индекса атерогенности. При этом выраженность метаболических нарушений у пациентов с СД 1 зависела от длительности диабета, стадии компенсации углеводного обмена и наличия сосудистых осложнений: было отмечено выраженное повышение содержания общего ХС у пациентов с течением заболевания более 5 лет или с сосудистыми осложнениями II и III стадии (рис. 1.). Пациенты с СД 2 характеризовались более выраженными и разнообразными отклонениями показателей липидного обмена: повышение содержания общего холестерина и триацилглицеридов в сыворотке крови наряду со снижением концентрации ХС ЛПВП (табл. 2).

Механизмы развития гиперхолестеринемии, как было указано выше, при сахарном диабете связаны с нарушением гормональной регуляции. При этом инсулярная недостаточность проявляется не только в нарушении углеводного и жирового обмена, но и активацией контринсулярных гормонов. Гипертриглицеридемия сопряжена с повышением содержания ЛПОНП. У пациентов, страдающих СД типа 2, в сыворотке крови было обнаружено увеличение концентрации всех подфракций ЛПОНП (табл. 2). Так, содержание ЛПОНП₁ у больных СД 2 превышало соответствующий показатель у здоровых доноров в 1,8 раз (р<0,01), а концентрация ЛПОНП₂ был выше в 2,2 раза (р<0,001) (табл. 2).

Как полагают исследователи, повышение образования ЛПОНП в печени происходит благодаря увеличенному поступлению жирных кислот [Cummings M.H., 1995], а также отсутствию ингибирующего влияния инсулина на продукцию и формирование ЛПОНП [Reaven G.M., 1981; Tobey T.A., 1981; Malmstrцm R., 1997]. Кроме того, обсуждается возможность увеличения синтеза жирных кислот в печени de novo [Shimomura I., 2000; Tobe K., 2001].

Таблица 2

Результаты исследования липопротеинового спектра сыворотки крови у больных сахарным диабетом типа 1 и 2, Me(Q₁-Q₃)