Важными характеристиками наночастиц при отработке технологии получения САНЧ являются их средний размер и дзета-потенциал. В следующей серии экспериментов нами были определены данные показатели: дзета-потенциал составил минус 44,3 мВ, средний размер частиц - 160-180 нм.
Остаточное количество ТГФ в готовом препарате определяли методом ГЖХ. Анализ полученных результатов показал, что отработанный метод ультрафильтрации обеспечивает эффективное удаление ТГФ, его концентрация в препарате составила 0,176±0,009 мг/мл. Последующая стадия лиофилизации способствовала снижению остаточной концентрации ТГФ до 0,122±0,004 мг/мл, т.е. почти на 30 %. Следует отметить, что по данным ГФ XII издания, предельно допустимое количество тетрагидрофурана, принимаемое в составе суточной дозы в лекарственных средствах, не должно превышать 7,2 мг/мл, что в 2360 раз меньше, чем при введении 25 мкг САНЧ (предполагаемое содержание в одной дозе вакцинного препарата).
Рис. 3. Схема технологии получения САНЧ
Токсические свойства препарата оценивали в опытах по определению острой и хронической токсичности. Для изучения острой токсичности белым мышам вводили препарат внутрибрюшинно однократно в дозе 0,5 мл (25 мкг САНЧ) на мышь (что соответствует 2994 человеческим дозам), морским свинкам (массой 300-350 г) - подкожно в дозе 5,0 мл (250 мкг САНЧ) на морскую свинку (что соответствует 1851 человеческой дозе). При изучении хронической токсичности белым мышам вводили САНЧ в концентрации 50 мкг/мл в дозе по 0,5 мл (25 мкг САНЧ) внутрибрюшинно трехкратно (1, 4, 9 сутки) в суммарной дозе 1,5 мл на мышь (что соответствует 8982 человеческим дозам). Животным группы сравнения водили 0,9 % раствор натрия хлорида по аналогичным схемам.
Результаты наблюдения показали, что однократное и многократное введение препарата не вызывало гибели животных, не приводило к снижению массы тела (табл. 12, 13), изменениям волосяного покрова, некробиотическим изменениям на месте введения.
Таблица 12. Динамика изменения массы животных после однократного введения препарата
|
Исследуемый препарат |
Вид животных |
Исходная масса животных, г |
Массы животных на 1 сут, г |
Массы животных на 8 сут, г* |
|
|
САНЧ |
Белые мыши |
18,24±0,14 |
18,58±0,184 |
21,48±1,24 |
|
|
Морские свинки |
317,50±2,10 |
320,50±1,90 |
367,00±3,50 |
||
|
NaCl 0,9% (контроль) |
Белые мыши |
18,09±0,16 |
18,30±0,14 |
22,20±0,98 |
|
|
Морские свинки |
324,10±2,39 |
327,50±2,03 |
372,10±4,15 |
Примечание: * - p>0,05 различие не значимо по сравнению с контролем
Таблица 13. Динамика изменения массы белых мышей после многократного введения препарата
|
Исследуемый препарат |
Исходная масса животных, г |
Массы животных на 1 сут, г |
Массы животных на 22 сут, г* |
|
|
САНЧ |
18,46±0,18 |
18,78±0,60 |
27,80±2,89 |
|
|
NaCl 0,9% (контроль) |
18,60±0,46 |
18,68±0,62 |
27,63±2,80 |
Примечание: * - p>0,05 различие не значимо по сравнению с контролем
Через 24 ч и 13 суток после последней инъекции при оценке хронической токсичности в группе сравнения и опытной группе внутренние органы животных имели все характерные признаки, расположение и строение. Оболочки, выстилающие внутренние полости влажные, серовато-розового цвета, без признаков воспаления.
Таким образом, при изучении острой и хронической токсичности было установлено, что адъювант САНЧ не вызывает симптомов интоксикации, не обладает токсическим действием на системы и органы лабораторных животных, не способствует развитию патологических, в том числе воспалительных, дистрофических и некротических изменений.
При отработке технологии получения САНЧ определяли их сорбционную способность. В результате было установлено, что САНЧ в концентрации 50 мкг/мл эффективно связывает поверхностный антиген вируса гепатита В (табл. 14).
Таблица 14. Определение сорбционной способности САНЧ
|
Концентрация САНЧ, мкг/мл |
Эффективность включения антигенов, % |
|||
|
дифтерийный анатоксин |
столбнячный анатоксин |
HBsAg |
||
|
50 |
3,59 |
5,84 |
96,56 |
|
|
100 |
1,24 |
1,34 |
97,85 |
|
|
200 |
9,91 |
3,11 |
98,92 |
|
|
400 |
13,56 |
14,73 |
99,47 |
|
|
500 |
29,35 |
20,98 |
99,39 |
В тоже время, как видно из данных таблицы 14, даже при концентрации САНЧ 500 мкг/мл эффективность связывания по отношению к дифтерийному и столбнячному анатоксину составляет менее 30 %. Поэтому в последующих сериях экспериментов по конструированию вакцинных композиций с использованием адъюванта САНЧ мы применяли поверхностный антиген вируса гепатита В и экспериментальную Split-вакцину против вируса гриппа (штамм Уругвай/716/2007/H3N2).
Результаты по оценке иммуногенных свойств приготовленных вакцинных композиций с использованием HBsAg представлены в таблице 15.
Таблица 15. Результаты изучения иммуногенных свойств вакцины против гепатита В с адъювантами различной природы в опытах на морских свинках
|
Вакцинные композиции (суммарная доза на одно животное) |
Средняя геометрическая титра (СГТ), мМЕ/мл |
||
|
I иммунизация |
II иммунизация |
||
|
20 мкг HBsAg+50 мкг САНЧ |
40,02* [17,53-91,35] |
1276,63** [830,24-1963,03] |
|
|
20 мкг HBsAg+500 мкг САНЧ |
44,92* [15,40-130,96] |
1192,26** [681,91-2084,57] |
|
|
Контроль коммерческая вакцина против гепатита В (20 мкг HBsAg+500 мкг Al(OH)3) |
22,81 [10,94-47,52] |
586,69 [401,97-856,30] |
Примечание: * - различия средних величин не существенны по сравнению с контролем; ** - различия средних величин существенны по сравнению с контролем
Из приведенных данных видно, что после первой иммунизации средняя геометрическая титра специфических антител в исследуемых группах животных практически не отличались. После второй иммунизации в группах животных, в которых использовался адъювант САНЧ, наблюдался достоверно более высокий уровень анти-НВs, чем в группе животных, иммунизированных коммерческой вакциной. При этом следует отметить, что снижение концентрации САНЧ в 10 раз не оказывало влияния на иммуногенные свойства вакцины против гепатита В. Различия величин СГТ сравниваемых групп не существенны. Таким образом, было показано, что адъювантирующие свойства САНЧ проявляются в концентрациях значительно меньших, чем широко используемый в качестве адъюванта гель гидроксида алюминия, обеспечивая высокую иммуногенность вакцины против гепатита В.
Данные по изучению иммуногенности вакцинных композиций с САНЧ против вируса гриппа приведены в таблице 16.
Таблица 16
Иммуногенные свойства вакцины против гриппа с адъювантом САНЧ
|
Вакцинные композиции |
Количество гемагглютинина (ГА) на одно животное, мкг |
Среднее геометрическое значение оптической плотности |
|
|
1,5 мкг ГА + 25 мкг САНЧ |
1,5 |
1,015[0,877-1,173]** |
|
|
1,5 мкг ГА + 250 мкг САНЧ |
1,5 |
0,791[0,596-1,051]** |
|
|
1,5 мкг ГА + 500 мкг САНЧ |
1,5 |
0,676[0,546-0,836]*** |
|
|
1.5 мкг ГА* |
1,5 |
0,551[0,429-0,708] |
Примечание: *- контроль (несорбированный гемагглютинин); ** - различия средних величин существенны по сравнению с контролем; *** - различия средних величин не существенны по сравнению с контролем
Представленные результаты ИФА показали, что САНЧ проявлял выраженные адъювантирующие свойства. Из препаратов с адъювантами максимальный уровень антител у животных обеспечила вакцинная композиция с низкой дозой САНЧ.
Таким образом, разработанная нами технология позволяет получать адъювант САНЧ стерильным и апирогенным с высокими адъювантирующими свойствами, которые могут быть использованы для конструирования высокоиммуногенных вакцинных препаратов.
По результатам проведенных исследований составлен проект Фармакопейной статьи предприятия на адъювант «Нанодисперсия САНЧ из смеси тритерпеноидов бересты лиофилизированная» в соответствии с требованиями ОСТа 91400.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения". Проект ФСП предусматривает контроль препарата по следующим показателям: описание, подлинность по кофеату бетулина, количественное определение, фотометрический показатель дисперсности, pH, потеря в массе при высушивании, остаточное количество тетрагидрофурана, пирогенность, токсичность, стерильность. Срок годности исследуется (табл. 17).
Таблица 17. Спецификация Нанодисперсия САНЧ из смеси тритерпеноидов бересты лиофилизированная
|
Показатели |
Методы |
Нормы |
|
|
1 |
2 |
3 |
|
|
Описание |
Визуальный |
Плотная пористая масса белого или желтовато-белого цвета. При добавлении к содержимому флакона 25 мл раствора воды для инъекций и интенсивном встряхивании в течение 1 мин должна образовываться дисперсия белого или желтовато-белого цвета. |
|
|
Подлинность |
Спектрофотометриче-ский |
Ультрафиолетовый спектр поглощения раствора субстанции (по кофеату бетулина) в области от 220 до 350 нм должен иметь максимум при 320 ±2 нм. |
|
|
Содержание тритерпеноидов бересты |
Спектрофотометрический |
0,95 - 1,05 мг/мл |
|
|
Фотометрический показатель дисперсности |
Фотоэлектроколориметрический |
От 2,0 до 2,6 |
|
|
рН |
ГФ ХII, Т.1, С.89, потенциометрически |
От 8,5 до 9,3 |
|
|
Остаточное количество тетрагидрофурана |
ГЖХ |
Не более 0,2 мг/мл |
|
|
Потеря в массе при высушивании |
ГФ ХI, Т. 1, С.176 |
Не более 5,0 % |
|
|
Стерильность |
Метод прямого посева, ГФ ХII, Т. 1, С.150 |
Дисперсия должна быть стерильна |
|
|
Токсичность |
Биологический, ГФ ХII, Т. 1, С.124 |
Дисперсия должна быть нетоксична |
|
|
Пирогенность |
Биологический, ГФ ХII, Т. 1, С.125 |
Дисперсия должна быть апирогенна |
|
|
Упаковка |
Во флаконы вместимостью 100 мл, укупоренные пробками из резины и завальцованные колпачками алюминиевыми. |
||
|
Хранение |
В соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 0С. |
||
|
Срок годности |
Срок наблюдения 12 месяцев |
В экспериментально-производственных условиях была приготовлена серия адъюванта САНЧ, которая прошла испытания с положительными результатами в филиалах ФГУП НПО «Микроген» в г. Пермь и в г. Иркутск.
ВЫВОДЫ
1. С использованием метода дегидратации/регидратации и последующей ультразвуковой обработки разработана технология получения лиофилизированной комбинированной липосомальной вакцины против дифтерии и столбняка и жидкой липосомальной моновакцины против гепатита В со средним размером частиц 120-170 нм и эффективностью включения антигенов не менее 75 %. Отработана система контроля технологического процесса и готового препарата.
2. Липосомальные вакцины, полученные по разработанной технологии, по показателям специфической активности, пирогенности, стерильности, токсичности полностью отвечали требованиям, предъявляемым к вакцинным препаратам. В опытах in vivo установлен выраженный адъювантирующий эффект липосом в отношении дифтерийного, столбнячного анатоксинов и поверхностного антигена вируса гепатита В. Липосомальная дифтерийно-столбнячная вакцина и липосомальная вакцина против гепатита В в опытах на животных проявили иммуногенные свойства, сопоставимые с аналогичными адсорбированными на геле гидроксида алюминия коммерческими вакцинами.
3. Разработана технология получения адъюванта на основе сферических аморфных наночастиц из смеси тритерпеноидов бересты. Отработаны методы контроля технологического процесса получения САНЧ и готового адъювантного препарата. Разработанная технология обеспечивает получение стерильного, апирогенного, нетоксичного адъюванта со средним размером частиц 160-180 нм, дзета-потенциалом минус 44,3 мВ. Разработан проект Фармакопейной статьи предприятия на САНЧ.
4. Получены вакцины на основе расщепленного вируса гриппа (штамм Уругвай/716/2007/H3N2) и рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В с использованием в качестве адъюванта САНЧ. В опытах на животных установлено, что экспериментальные вакцинные препараты по иммуногенности превосходили базовые вакцины и по показателям стерильности, пирогенности, токсичности полностью отвечали требованиям, предъявляемым к вакцинным препаратам.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Иванов, А. В. Экспериментальные подходы к получению липосомальной формы коклюшной вакцины // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство : сб. материалов конгр. : тез. докл., Москва, 12-16 апр. 2010 г. - Москва, 2010. - С. 623-624.