Автореферат: Разработка и использование адъювантов на основе наночастиц в технологии вакцинных препаратов

Специфическую активность анатоксинов и их липосомальных дисперсий оценивали в реакции коагглютинации (РКОА) с диагностическими реагентами на основе аффинноочищенных антител (экспериментальные серии филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»). Для определения специфической активности HBsAg применяли реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроцитарным диагностикумом производства НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород).

Определение специфической активности антигенов в иммуноферментном анализе проводили с помощью следующих тест-систем: иммуноферментной тест-системы для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В «ИФА-HВsAg» производства НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород); экспериментальной иммуноферментной тест-системы для выявления дифтерийного и столбнячного антигенов на основе F(ab)2-фрагментов дифтерийных и столбнячных антител, меченных пероксидазой хрена (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»).

Для анализа полученных наночастиц на основе липосомальных структур и САНЧ были использованы фотометрические и спектрофотометрические методы: определение ФПД, индекса окисления фосфолипидов.

Определение средних размеров фосфолипидных частиц методом лазерного корреляционного светорассеяния и определение дзета-потенциала с помощью электрофоретического рассеяния проводили на приборе Zetasizer Nano ZS фирмы Malvern.

Точку эвтектики для липосомальной вакцины против дифтерии и столбняка (ЛДС-М) и САНЧ при отработке режима лиофилизации определяли методом анализа зависимости электрического сопротивления от температуры.

Лиофилизацию полученных образцов проводили с помощью аппарата для сублимирования ТГ-50 (Германия) на базе филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермский НПО «Биомед».

Оценку полученных экспериментальных образцов проводили в соответствии с Европейской Фармакопеей и отечественными нормативными документами по следующим показателям: стерильность, пирогенность, токсичность, иммуногенность. Стерильность и пирогенность определяли по ГФ ХII издания. Токсические свойства ЛДС-М и САНЧ оценивали в экспериментах по изучению острой и хронической токсичности согласно основным положениям РД 42-28-8-89 «Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов». Иммуногенную активность компонентов ЛДС-М вакцины по показателю выживаемости устанавливали по резистентности иммунизированных морских свинок (масса 300±50 г) к дифтерийному тест-токсину и по резистентности иммунизированных белых мышей (масса 17±1 г) к столбнячному тест-токсину. Иммуногенную активность липосомальных вакцин и вакцин на основе САНЧ по индуцированию специфических антител определяли в опытах на морских свинках и белых мышах. Уровень антител в сыворотках иммунизированных животных оценивали с помощью иммуноферментного метода, используя экспериментальные тест-системы для определения дифтерийных, столбнячных и гриппозных антител, разработанные в филиале ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» и коммерческие тест-системы для определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В производства фирмы «BIO-RAD» и НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород).

Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985).

Третья глава посвящена разработке технологии получения липосомальных композиций, отвечающих требованиям к вакцинным препаратам по показателям стерильности, пирогенности, токсичности на модели дифтерийного, столбнячного анатоксинов и поверхностного антигена вируса гепатита В.

Дизайн проведенных исследований по разработке технологии получения липосомальных вакцинных композиций представлен в таблице 1.

Первоначально в исследованиях при оценке качества лецитина - исходного сырья для конструирования липосомальных вакцин, по показателю пирогенности и индекса окисления, который характеризует стабильность липидных мембран, нами было показано, что липидная субстанция по показателю пирогенности соответствует фармакопейным требованиям к парентеральным препаратам и по индексу окисления (0,160±0,003) соответствует нормам, предъявляемым к фосфолипидам при получении липосомальных лекарственных форм.

липосомальный аморфный наночастица вакцинный

Таблица 1.. Дизайн исследования по разработке технологии получения липосомальных вакцинных композиций

При создании липосомальных вакцин следует учитывать физико-химические свойства каждого отдельного антигена, чтобы избежать снижения эффективности препарата. Различия в термостабильности антигенов определяют особенности конструирования липосомальных вакцин. Для обоснования выбора метода получения липосомальной композиции мы проводили исследования по определению устойчивости к повышенной температуре антигенного материала. В модельных опытах антигены прогревали при различных температурах в течение 2 часов в соответствии с длительностью термообработки при использовании метода обращения фаз (табл. 2).

Таблица 2. Оценка сохранения специфической активности в образцах исследуемых антигенов после термообработки методом ИФА

Из представленных данных видно, что наиболее стабильным оказался гепатитный антиген, анатоксинные компоненты менее устойчивы к воздействию повышенных температур. Столбнячный анатоксин в течение 2-х часовой обработки при 450С терял 40 % своей активности. Поэтому при отработке способа получения ЛДС-М вакцины за основу был выбран метод дегидратации/регидратации. В свою очередь, HBsAg вплоть до температуры 80 0С сохранял свою активность.

На основании результатов этих опытов для изготовления липосомальной вакцины против гепатита В нами испытаны 2 метода получения: дегидратации/регидратации и метод обращения фаз (табл. 3).

Таблица 3. Результаты ИФА по определению специфической активности липосомальной вакцины против гепатита В

Несмотря на высокую термоустойчивость гепатитного компонента, его исходная специфическая активность не сохранялась при использовании метода выпаривания с обращением фаз за счет денатурирующего действия органических растворителей на антигенный белок. В связи с этим для получения липосомальной вакцины против гепатита В был выбран метод дегидратации/регидратации.

Отрабатывая начальные технологические стадии получения липосомальных композиций, мы выбрали оптимальное соотношение лецитина и антигенных компонентов (дифтерийно-столбнячный анатоксин / лецитин - 1:1, поверхностный антиген вируса гепатита В / лецитин 1:1), и в качестве раствора для регидратации липидной пленки - 0,01 М трис-HCl буфер, рН 7,0-7,2.

В технологии получения липосомальных препаратов ультразвуковая обработка является одним из основных приемов для гомогенизации дисперсий.

В связи с этим в следующей серии экспериментов для гомогенизации полученных мультиламеллярных липосомальных дисперсий дифтерийно-столбнячной вакцины отрабатывали оптимальный режим ультразвуковой обработки (УЗ) (табл.4).

Из приведенных в таблице данных видно, что при увеличении длительности УЗ обработки показатели оптической плотности снижались, значения ФПД увеличивались, что соответствовало уменьшению размера частиц. Оптимальная продолжительность УЗ обработки составила 25-30 минут.

После 25 минутной обработки дисперсии обладали хорошей смачивающей способностью, имели голубоватый оттенок.

Таблица 4. Отработка режимов ультразвуковой обработки липосомальных дисперсий дифтерийно-столбнячной вакцины

Примечание: * - липосомальная дисперсия до обработки ультразвуком

Отработанные условия УЗ обработки позволили получить липосомальные вакцинные композиции, визуально отвечающие критериям истинных липосомальных дисперсий.

В результате действия ультразвука в процессе приготовления липосомальных дисперсий возможно снижение активности инкапсулируемого материала. Поэтому далее определяли уровень специфической активности липосомальной комбинированной вакцины ЛДС-М и моновакцины против гепатита В в тесте ИФА. В качестве контрольных препаратов использованы исходные очищенные дифтерийный и столбнячный анатоксины, а также HBsAg. Полученные результаты иммуноферментного анализа представлены в таблице 5.

Таблица 5. Оценка специфической активности липосомальных вакцин после УЗ обработки

Примечание: * - p>0,05 различие не значимо по сравнению с контрольным препаратом

Таким образом, проведенные исследования показали, что ультразвуковая обработка не снижает специфическую активность испытуемых липосомальных вакцин и, следовательно, может быть включена в технологию получения липосомальных препаратов на основе дифтерийно-столбнячного анатоксинов и HBsAg. При выбранном режиме ультразвукой обработки в течение 25-30 минут образовывались липосомальные дисперсии, способные проходить через стерилизующие мембраны, что позволило проводить стерилизацию на конечном этапе производства, используя мембранную технологию.

Доказательством включения смеси анатоксинов и HBsAg в липосомы явились результаты гельхроматографии липосомальных дисперсий. Было установлено, что эффективность включения для дифтерийного анатоксина - 94,43 %, столбнячного - 96.98 %, гепатитного компонента - 76,90 %.