Автореферат: Разработка и использование адъювантов на основе наночастиц в технологии вакцинных препаратов

Важное значение для характеристики липосомальных вакцин имеют следующие показатели: средний размер, индекс полидисперсности и дзета-потенциал. Индекс полидисперсности характеризует гетерогенность системы, которая может колебаться от 0 (100% гомогенность) до 1,0 (100% гетерогенность). Дзета-потенциал - величина, отражающая взаимное влияние друг на друга дисперсной среды и диспергированной частицы, является важным индикатором поверхностного заряда частиц. Этот показатель может быть использован для прогнозирования и контроля устойчивости коллоидных суспензий или эмульсий (табл. 6).

Таблица 6. Характеристика липосомальных вакцинных препаратов

Из приведенных данных видно, что средние размеры липидных частиц и их способность включать антигены позволяют охарактеризовать полученные нами структуры как липосомы. Дзета-потенциал липосомальной вакцины против гепатита В имеет высокое значение, что свидетельствует о стабильности этой композиции. Вместе с тем дзета-потенциал ЛДС-М вакцины составил минус 3,90 мВ. По данным литературы [Heurtault B., 2003], такое значение дзета-потенциала свидетельствует о недостаточной стабильности полученной липосомальной дисперсии.

В связи с этим были проведены эксперименты по стабилизации липосомальных дисперсий с помощью лиофилизации. Отработку процесса высушивания проводили с учетом его влияния на физические свойства и специфическую активность липосомальной вакцины. В результате был отработан следующий режим лиофилизации: замораживание препарата ниже температуры (-35 0С) и выдерживание при этой температуре не менее 4 часов; проведение стадии лиофилизации при температуре препарата (-35 0С) в течение 15 часов; досушивание препарата при плюсовых температурах продолжительностью 15 часов.

В качестве защитной среды использовали наиболее доступный углевод сахарозу, которую добавляли в различных концентрациях (2, 4, 6, 8 %). Было установлено, что при использовании концентраций сахарозы от 2 до 6 % препарат обладал высокой гигроскопичностью, что приводило к плавлению массы и снижению активности дифтерийного и столбнячного компонентов. Использование сахарозы в концентрации 8 % обеспечивало образование плотной пористой массы и сохранение специфической активности антигенов на исходном уровне. При этом были получены липосомы стандартного состава, основная масса которых состояла из частиц размером 150-170 нм.

Установлено, что разработанный режим сублимации и выбранная концентрация криопротектора (8 %) обеспечивают остаточную влажность основной массы ЛДС-М вакцины в диапазоне (3,5±0,5) % и её стабильность в течение 12 месяцев (максимальный срок наблюдения) (табл. 7).

Таблица 7. Изучение стабильности лиофилизированной липосомальной дифтерийно-столбнячной вакцины

После определения основных технологических параметров получения лиофилизированной липосомальной дифтерийно-столбнячной вакцины и липосомальной вакцины против гепатита

В представлялось целесообразным изучить качественные характеристики полученных препаратов, из которых основной является иммуногенность.

Результаты испытания иммуногенных свойств по протективной активности ЛДС-М вакцины представлены в таблице 8.

Таблица 8. Результаты изучения протективной активности ЛДС-М вакцины в опытах на животных

Примечание: *- препарат сравнения

Из данных таблицы видно, что разработанный липосомальный препарат обеспечивает резистентность иммунизированных морских свинок и белых мышей к дифтерийному и столбнячному токсину. Показатель выживаемости в обеих группах животных составил 100 % при регламентированных требованиях к АДС-М вакцине: 100 % для дифтерийного компонента и не менее 70 % для столбнячного компонента.

Дополнительные испытания липосомального препарата в опытах на морских свинках показали, что группы животных, в которых использовался ЛДС-М, имели уровень антител, сопоставимый с уровнем индуцируемым АДС-М анатоксином, адсорбированном на геле гидроксида алюминия (табл. 9).

Таблица 9. Результаты изучения иммуногенных свойств липосомальной ЛДС-М вакцины в опытах на морских свинках

Примечание: * - контроль; ** - различия средних величин не существенны по сравнению с контролем

Результаты испытания иммуногенных свойств ЛВГВ вакцины приведены в таблице 10.

Таблица 10. Результаты изучения иммуногенных свойств вакцины против гепатита В с адъювантами различной природы

Примечание: *- контроль; ** - различия средних величин не существенны по сравнению с контролем

Из представленных данных видно, что после первой и второй иммунизации средняя геометрическая титра анти-HBs в опытной и контрольной группе животных не отличались. Полученные результаты демонстрируют высокие иммуногенные свойства ЛВГВ, сопоставимые с вакциной против гепатита В, адсорбированной на геле гидроксида алюминия.

Разработанные формы липосомальных вакцин не обладали пирогенными свойствами и по показателям стерильности, токсичности, иммуногенности полностью соответствовали требованиям, предъявляемым к коммерческим вакцинным препаратам. Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность липосомальных вакцинных препаратов. На основании полученных данных можно сделать вывод о перспективности использования липосом в качестве адъювантов вакцин.

По результатам проведенных исследований были разработаны технологии получения липосомальных форм вакцинных препаратов, схемы которых представлены на рисунках 1, 2.

Рис. 1. Схема технологии получения лиофилизированной ЛДС-М вакцины

Рис. 2. Схема технологии получения жидкой ЛВГВ вакцины

На начальных технологических стадиях производства липосомальных вакцин проводят упаривание спиртового раствора липидов на роторном испарителе до полного удаления спирта и образования тонкой липидной пленки на стенках колбы при давлении -90 Па в течение 1,5-2 часов. Далее липидную пленку гидратируют в трис-буфере, содержащем антиген, при температуре 41-43 0С. Таким образом получают дисперсию мультиламеллярных везикул с включенным антигеном. На следующей технологической стадии проводят гомогенизацию ультразвуком в течение 30 минут при 35 kHz и температуре 41-43 0С. Для стандартизации технологического процесса получения липосом на данной стадии необходимо контролировать оптическую плотность полуфабриката при двух длинах волн 540 нм и 400 нм, средний размер частиц, ФПД, а также специфическую активность. Оптическая плотность и размер липосом после ультразвуковой обработки должны уменьшаться, а специфическая активность антигенов должна оставаться на исходном уровне. На последующих стадиях проводят стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и контролируют стерильность. Для стабилизации липосомальной вакцины против дифтерии и столбняка предусмотрена стадия лиофилизации. ЛВГВ стабильна в жидком виде, ее лиофилизации не подвергают. В течение срока наблюдения (12 месяцев) вакцина оставалась гомогенной, не имела признаков расслоения. Соблюдение всех отработанных параметров технологического процесса гарантирует получение стандартного препарата.

В четвертой главе изложены результаты по разработке технологического процесса получения адъюванта САНЧ из СТБ, соответствующего требованиям к вакцинным препаратам для парентерального введения, по отработке методов контроля технологического процесса и стандартизации готового адъювантного препарата САНЧ, а также представлены данные по изучению иммунобиологических свойств САНЧ.

Дизайн проведенных исследований по разработке технологии получения САНЧ представлен в таблице 11.

Таблица 11

Дизайн исследования по разработке технологии получения САНЧ

При разработке новых адъювантов и при внедрении их в медицинскую практику следует тщательно изучить все стороны их действия, учитывая требования по стерильности, пирогенности, токсичности. Выполняя этот раздел исследований, первоначально мы считали необходимым выбрать оптимальный метод стерилизации САНЧ, который можно было бы применить на заключительной технологической стадии производства. Для получения стерильного адъюванта оценивалась возможность использования термических и мембранных методов стерилизации. При отработке методов мембранной технологии для стерилизации было установлено, что на поверхности фильтров из нейлона, полиэфирсульфона, ацетатацеллюлозы происходит сорбция САНЧ. Термическая обработка, нарушая структуру аморфных наночастиц, вызывала их агрегацию. Таким образом, стерилизация САНЧ мембранными и термическими методами на конечных этапах производства невозможна. С целью получения адъюванта, отвечающего требованиям к препаратам для парентерального введения, мы отработали технологию, в которой все исходные растворы должны стерилизоваться на начальных этапах производства САНЧ, и весь дальнейший технологический процесс должен проходить в стерильных условиях.

Поэтому мы предложили мембранную технологию стерилизации исходной смеси СТБ/ТГФ с помощью фильтроэлемента с модифицированным поверхностным зарядом, который обладал низкой сорбционной способностью в отношении СТБ и устойчивостью к ТГФ.

Основной стадией получения САНЧ является осаждение частиц при смешивании со стерильным буферным раствором. В результате последующей обработки ультразвуком в течение 5 минут образовывались гомогенные дисперсии САНЧ.

На следующем этапе наших исследований отрабатывали метод очистки дисперсии САНЧ. С целью удаления токсичного ТГФ применяли ультрафильтрацию на полых волокнах с номинальной отсекающей молекулярной массой 300 кДа в режиме ультрадиафильтрации. Для определения оптимальных условий ультрафильтрации была отработана система контроля процесса по следующим параметрам: ФПД, концентрации смеси тритерпеноидов бересты и ТГФ.

Лиофилизацию САНЧ проводили с учетом значения зоны эвтектической температуры по режиму сублимации, отработанному для липосомальной вакцины против дифтерии и столбняка. В результате проведенных исследований была разработана технология получения САНЧ, схема которой представлена на рисунке 3.

Контроль готового препарата осуществляли по следующим показателям: описание, подлинность, количественное определение СТБ, остаточное количество ТГФ, pH, показатель дисперсности, потеря в массе при высушивании, стерильность, токсичность, пирогенность.