Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
Российского федерального агентства здравоохранения и социального развития
Фармацевтический факультет
Кафедра
управления и экономики фармации и фармацевтической технологии
Курсовая работа
на тему:
Принципы
технологии получения противоопухолевых препаратов на основе моноклональных
антител
Выполнила: студентка IV курса
группы № 474
Соловьева О.Н.
Руководитель: к.б.н.
Горлова И.С.
Н.Новгород,
2015
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ГИБРИДОМНОЙ ТЕОРИИ
2.1 ИММУНИЗАЦИЯ
2.2 СТАДИЯ СЛИЯНИЯ
2.3 СТАДИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ГИБРИДОМ В КУЛЬТУРЕ
2.4 СТАДИЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ.
2.5 ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА МКАТ
2.6 ПОЛУЧЕНИЕ ГОТОВОГО ПРЕПАРАТА
2.7 КОНТРОЛЬ ГОТОВОГО ПРЕПАРАТА
3. КЛАССИФИКАЦИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ МКАТ
4. МЕХАНИЗМ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ
5. КЛИНИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МКАТ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ГАТ - культуральная среда, содержащая гипоксантин - аминоптерин - тимидин
МкАТ - моноклональные антител
НАФ - неполный адъювант Фрейнда
ПАФ
- полный адъювант Фрейнда
1. ВВЕДЕНИЕ
Моноклональные антитела - это антитела, являющиеся продуктом одного клона и обладающие строго определённой специфичностью по отношению к антигенам. Моноклональные антитела гомогенны как по специфичности, так и по физико-химическим свойствам.
Современная технология получения моноклональных антител основана
на совместном применении двух независимо возникших биологических подходов.
Первый из этих подходов связан с получением индуцированных миелом у мышей. Эти опухоли представляют собой продукты злокачественной пролиферации единичных клонов В-клеток, каждый из которых секретирует иммуноглобулины одного какого-то вида, причем некоторые из этих иммуноглобулинов реагируют с антигенами окружающей среды.
Второй метод заключается в получении гибридов путем слияния двух
соматических клеток. Разработка техники гибридизации соматических клеток широко проводилась после открытия феномена спонтанной гибридизации. При слиянии плазматических мембран клеток образуются клетки с двумя или большим числом ядер - гетерокарионы. После первого деления ядра сливаются и образуется одно ядро с набором хромосом от всех партнеров - образуется гибридная клетка. Низкую частоту слияния клеток увеличивают используя ряд реагентов: вирус Сендай, лизолецитин, полиэтиленгликоль (ПЭГ) [4] .
Гибридома, полученная в результате слияния антителообразующей клетки лимфоидной ткани иммунизированного животного и клетки плазмацитомы, наследует от одной родительской клетки способность к секреции антител определенного идиотипа и от другой (клетки плазмацитомы) - способность к неограниченному росту in vitro.
На современном этапе созданы десятки тысяч
высокоаффинных антител, связывающихся с белками, углеводами, нуклеиновыми
кислотами, а также низкомолекулярными антигенами. На их основе получены
коньюгаты с различными функциональными соединениями, токсинами, ферментами,
магнитными частицами, радиоактивными и рентгеноконтрастными атомами и т.п. Эти
коньюгаты находят широчайшее применение в научных исследованиях, медицине,
ветеринарии.
2. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ГИБРИДОМНОЙ ТЕОРИИ
Смысл гибридомной технологии заключается в создании гибридной клетки (получившей название «гибридома»), получаемой путем слияния антителопродуцирующего В-лимфоцита и опухолевой клетки миеломного или плазмацитомного ряда. Такая гибридома, как уже было сказано ранее, обладает свойством секретировать антитела, взятой у В-лимфоцита, и способностью к бесконечному делению, взятой у опухолевой клетки.
Источником В-лимфоцитов для получения гибридомы служат лимфоидные органы животного, гипериммунизированного тем антигеном, против которого хотят получить МкАТ. Гипериммунизация сильно повышает процентное содержание В-лимфоцитов, продуцирующих антитела желаемой специфичности, в общей популяции клеток лимфоидного органа. Лимфоциты, выделенные из тканей селезенки, лимфоузлов, периферической крови, не способны к самостоятельному делению и живут в культуре всего 10-14 дней. Миеломные клетки, напротив, могут жить и делиться в культуре сколь угодно долго, но не продуцируют антитела нужной специфичности (чаще используют линии миелом или плазмацитом, вообще не продуцирующие никаких антител).
В результате процедуры гибридизации (слияния) образуется гетерогенная популяция клеток, состоящая:
во-первых, из неслившихся клеток лимфоидного органа;
во-вторых, из неслившихся клеток миеломы;
в-третьих, из гибридов лимфоцит+лимфоцит и миелома+миелома;
в четвертых, из гибридов лимфоцит+миелома, из которых лишь часть стабильно продуцирует антитела нужной специфичности.
Понятно, что необходимо отделить интересующие клетки от всех остальных. От неслившихся лимфоцитов и гибридов лимфоцит + лимфоцит избавляться не нужно: через несколько дней они погибнут сами; от неслившихся опухолевых клеток и гибридов миелома + миелома избавляются с помощью селективных сред; среди оставшихся клеток (гибридов лимфоцит + миелома) отбирают нужные путем клонирования, когда из одной клетки выращивают популяцию клеток (клеточный клон) и отбирают среди таких клонов лишь те, которые стабильно продуцируют антитела требуемой специфичности [8].
Рассмотрим теперь подробнее каждый из этапов получения
МкАТ.
.1 ИММУНИЗАЦИЯ
В первую очередь необходимо выбрать объект иммунизации. На сегодняшний день известны три вида гибридомных систем: мышиная, крысиная и человеческая. Самой распространенной сегодня является мышиная гибридома, а самая редкая - человеческая, чему имеется ряд причин:
а) мыши - наиболее хорошо изученный и доступный объект для работы в лаборатории, то же относится и к линиям мышиных миелом, используемых для слияния.
б) все линии крысиных миелом, адаптированные для гибридомных работ, запатентованы, поэтому коммерческое использование крысиных гибридом регламентируется соответствующими патентами.
в) гипериммунизацию грызунов провести проще, чем иммунизацию человека. В большинстве случаев гипериммунизация человека вообще невозможна по этическим соображениям.
г) источником иммунных В-лимфоцитов грызунов могут служить ткани любых лимфоидных органов, тогда как у человека возможно лишь взять периферическую кровь, где общее содержание В-лимфоцитов не превышает 20% от всех клеток.
д) при получении человеческой гибридомы существует проблема гистосовместимости клеток миеломы и В-лимфоцитов: у грызунов для слияния берутся В-лимфоциты и клетки миеломы, полученные от одной линии животных, и поэтому имеющих сходный репертуар антигенов гистосовместимости на клеточных поверхностях. Для человека это условие недостижимо, что в конечном итоге выражается очень низкой эффективностью слияния и крайне нестабильной антителопродукцией человеческих гибридом.
е) мышиные и крысиные антитела достаточно просто нарабатывать в асцитных жидкостях; для человеческих гибридом возможна наработка лишь в культуре, либо с применением генноинженерных методов [3].
Для иммунизации могут быть использованы мыши в возрасте 3-4 месяцев любого пола. Важно установить, что у мышей, клетки которых предполагается использовать в экспериментах по слиянию, в ответ на введение данного иммуногена образуются антитела. Известны 2 схемы иммунизации:
. короткая схема иммунизации заключается в том, что антиген вводят дважды с двухнедельным интервалом в подушечки задних лап. Количество вводимого антигена берут в пределах от 5 до 200 мкг на мышь в зависимости от его доступности и иммуногенности, для токсичных антигенов доза может быть понижена до 0,1 мкг. Для первого введения антигена (раунда иммунизации) раствор антигена объемом 50-200 мкл смешивают с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), представляющего собой минеральное масло со взвесью убитых микобактерий. При активном перемешивании раствора антигена с ПАФ получается мелкодисперсная эмульсия, призванная замедлить и пролонгировать поступление антигена в ткани. Считается, что убитые микобактерии усиливают иммунный ответ. Второй раунд иммунизации проводят так же, как и первый, но с использованием неполного адъюванта Фрейнда (НАФ), в котором отсутствуют микобактерии.
В случае проблемных антигенов полезно иммунизировать группу животных разными дозами антигена и с использованием разных схем иммунизации. На третий или четвертый день после второго раунда иммунизации нужно взять пробы крови и проанализировать их на содержание антител против требуемого антигена. Для дальнейшей работы выбирают животное с максимальным титром. На четвертый день после второго раунда иммунизации животное забивают, и клетки подколенных лимфоузлов сливают с клетками миеломы;
) в случае неэффективности короткой схемы иммунизации используют различные виды длинных схем. При этом обычно животных иммунизируют с интервалом 2-4 недели либо внутрибрюшинно, либо подкожно (реже внутривенно или орально), используя для первого раунда иммунизации ПАФ, а для последующих - НАФ.
На 10-14 день после каждого раунда иммунизации (начиная со второго) кровь иммунизируемых животных проверяют на содержание специфических антител. Если титр антител достиг желаемого уровня, проводят последний раунд иммунизации (называемый бустированием), вводя раствор антигена внутривенно без адъювантов, в количестве 1/10 от предыдущих доз. В результате бустирования избирательно стимулируются клоны, продуцирующие антитела высокой аффинности к антигену [3] .
Некоторые приемы, позволяющие усилить иммунный ответ:
. конъюгация (химическая сшивка) низкомолекулярного антигена (гаптена) с белком - носителем. Существует целый ряд низкомолекулярных соединений, не способных самостоятельно вызвать иммунный ответ по причине малого размера молекулы. В таких случаях гаптен конъюгируют с белком - носителем (часто в качестве белка - носителя берут бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин или гемоцианин улитки) и такой конъюгат используют для иммунизации. При этом возникает целый ряд проблем:
а) основной иммунный ответ будет направлен на белок - носитель, а не на молекулу гаптена, и это нужно будет учитывать при тестировании сывороток иммунизируемых животных и супернатантов гибридом. Тестирование должно отражать содержание антител именно к гаптену, а не к конъюгату в целом.
б) Пространственное строение гаптена (конформация), как правило, существенно изменяется в процессе конъюгирования с носителем, иногда настолько, что все антитела против участков гаптена, находящегося в составе конъюгата, не способны узнавать свободную молекулу гаптена. В таких случаях пробуют разные варианты конъюгирования, которые затрагивают при сшивке разные функциональные группы молекулы гаптена, либо используют разные «линкеры»- органические соединения, связывающие функциональные группы гаптена и белка- носителя и увеличивающие экспонированность гаптена на поверхности носителя.
Б) В том случае, когда мышей иммунизируют клетками человека, наблюдается выраженный ответ на видоспецифические антигены. Для того, чтобы направить иммунный ответ мышей на антигены, селективно экспрессированные на поверхности определенных клеток, может быть использован метод «маскировки» антителами. Например, он был успешно использован при получении моноклональных антител, специфичных к антигенам, избирательно эксперссированным на клетках миелоидного ряда человека. Клетки миелоидного ряда, которыми иммунизировали мышей для эксперимента по гибридизации, были нагружены мышиными антителами к лейкоцитам периферической крови человека. Смысл данного подхода заключается в том, что, нагружая клетки, удается замаскировать иммуногенные поверхностные белки, экспессируемые клетками человека.
Введенный внутрибрюшинно или внутривенно антиген
достигает селезенки, и с этого момента данный орган обычно становится
источником антитело-продуцирующих клеток, которые используются в экспериментах
по слиянию [3].
2.2 СТАДИЯ СЛИЯНИЯ
Успех экспериментов по гибридизации во многом зависит от тщательного и адекватного манипулирования с клетками во время процесса их слияния. В качестве сливающего агента используют полиэтиленгликоль. На стадии слияния выделяют следующие этапы:
. суспензии клеток селезенки или лимфатического узла, выделенных из иммунизированной мыши, получают стандартным способом в «ледяном» забуференном фосфатами физиологическом растворе.
. клетки миеломы выращивают в среде RPMI-1640, содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коровы (10-20%), пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин 100 мкг/мл), амфотерицин (0,25 мкг/мл) и 2-меркаптоэтанол (5*10-5 М). Такая среда называется полной средой. Она же используется и для добавления ГАТ - ингредиентов (культуральная среда, содержащая гипоксантин - аминоптерин - тимидин). Состав данной среды обусловлен следующими факторами. Нормальные соматические клетки (В-лимфоциты) могут использовать два метаболических пути синтеза нуклеотидов (пуринов и пиримидинов): основной и резервный путь.
В случае основного пути синтеза de novo нуклеотидов они образуются из аминокислот и углеводных предшественников. При резервном пути синтез нуклеотидов осуществляется из гипоксантина или дезокситимидина. Если по каким-либо причинам основной метаболический путь синтеза нуклеотидов блокируется (например, аминоптерином), то в нормальных клетках используется резервный путь синтеза нуклеотидов. В таком случае включается в работу фермент гипоксантин-гуанидин фосфорибозилтрансфераза и тимидинкназа, что обеспечивает синтез нуклеотидов по запасному пути. Клетки миеломы, используемые для гибридизации с В-лимфоцитами, отбираются мутантные, и у них отсутствуют указанные выше ферменты, таким образом такие клетки способны синтезировать нуклеотиды только по основному метаболическому пути [8].
Клетки миеломы, находящиеся в логарифмической фазе роста, собирают и отмывают однократно бессывороточной средой RPMI-1640.
. Равные количества миеломных и лимфоидных клеток смешивают и дважды отмывают путем центрифугирования в бессывороточной среде RPMI-1640 при 37°С.
. К осадку клеток, разбитому с помощью легкого потряхивания центрифужной пробирки, добавляют 1 мл предварительно нагретого 40%-ного раствора ПЭГ. Клетки инкубируют около 1 мин в присутствии ПЭГ, который затем медленно разбавляют бессывороточной средой RPMI, добавляемой по каплям 5 мл в течение первых пяти минут, и затем более быстро еще 15-20 мл). После этого клетки центрифугируют и осторожно переносят с помощью пипетки во флакон, содержащий предварительно нагретую среду ГАТ.
. На этой стадии к слившимся клеткам могут быть добавлены сингенные фидерные (питающие) клетки. Их получают, инъецируя 5-8 мл полной среды в брюшную полость неиммунизированной мыши. При обратном изъятии большей части этого объема отбирается такое количество перитонеальных макрофагов, которое достаточно для получения примерно 120 мл среды, содержащей фидерные клетки. Другими источниками фидерных клеток служат нормальная селезенка и тимус.