Четвертая группа (7 мужчин и 13 женщин) состояла из пациентов с ГБ длительностью 4-19 лет, на фоне которой впервые развился острый ишемический инсульт (ОИИ) в каротидном бассейне. Среднее САД у больных ОИИ составляло 148±16 мм рт.ст., ДАД - 87±8 мм рт.ст. Методом компьютерной томографии у пациентов данной группы оценивали размер очага инфаркта мозга в динамике на 1, 3, 7 и 21 сутки госпитализации (Ефремова Н.М., 2003). Для объективизации тяжести состояния больных в остром периоде ишемического инсульта были использованы различные клинические шкалы: шкала NIH (National Institutes of Health Stroke Scale) (Brott T. et al., 1989) для оценки степени выраженности неврологического дефицита (отсутствие изменений в неврологическом статусе оценивается как 0 баллов, грубый неврологический дефицит - 55 баллов) и шкала Orgogozo (Orgogozo J.M. et al., 1992) для оценки общей тяжести состояния больных и выраженности неврологического дефицита (оценка в 0 баллов соответствует смерти пациента, 100 баллов - отсутствию неврологического дефекта).
При формировании всех групп пациентов были использованы следующие критерии исключения: 1) вторичная артериальная гипертензия; 2) заболевания периферической нервной системы; 3) эпилепсия или клинически значимые психические заболевания; 4) инфекционные заболевания; 5) травмы головного мозга; 6) коагулопатии; 7) хроническая печеночная, почечная и легочная недостаточность; 8) аутоиммунные заболевания; 9) сахарный диабет; 10) злокачественные новообразования; 11) нейродегенеративные заболевания.
Таким образом, проведенное клиническое обследование пациентов, привлеченных в данное обследование, показало, что одной из основных этиологических причин, вызвавших недостаточность кровоснабжения головного мозга, являлась ГБ.
Белки S100b, HLDF и ауто-АТ к ним определяли в сыворотке периферической крови, взятой из кубитальной вены по стандартной методике в условиях асептики. Образцы крови центрифугировали при 3000 об/мин, сыворотку отбирали, аликвотировали и хранили при -80°С до проведения исследования. Определение иммунобиохимических показателей проводилось методом гетерогенного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА; Ensyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) (Самуилов В.Д., 1999; Rich R.R. et al., 2001; Wilhelm K.R. et al., 2007), модифицированным в лаборатории функциональной нейрохимии УРАМН НИИ НФ им. П.К. Анохина РАМН (Gruden M.A. et al., 2007). Содержание белка S100b определяли путем сорбции исследуемой сыворотки непосредственно на полистироловый планшет с последующим выявлением S100b с помощью кроличьих моноспецифических поликлональных антител к S100b (ИБХ РАН). Содержание белка HLDF определяли «сэндвич»-методом с использованием поликлональных моноспецифических антител крысы (НИИ НФ РАМН) и кролика (ИБХ РАН) к различным антигенным детерминантам белка HLDF. Для определения идиотипических ауто-АТ к S100b и к HLDF в качестве тест-антигенов использовали раствор белка S100b (Sigma, USA) и белка HLDF (ИБХ РАН) соответственно. Для определения антиидиотипических ауто-АТ к S100b и к HLDF в качестве тест-антигенов использовали аффинноочищенные моноспецифические поликлональные антитела кролика к белкам S100b и HLDF соответственно. Исследуемые сыворотки титровали для получения последовательных разведений от 1:100 до 1:12800. Полученные результаты выражали в титрах - последнее разведение сыворотки, при котором регистрировалась оптическая плотность, превышающая таковую в контрольной лунке.
Иммунобиохимическое исследование проводилось однократно в контрольной группе и у пациентов с не осложненной ГБ. При ГК и ОИИ определение иммуно-биохимических показателей проводилось динамике на 1-е, 3-е, 7-е и 21-е сутки от поступления в стационар.
Статистическую обработку данных проводили по алгоритму пакета программ «Statistica» (версия 6.0) с использованием описательной статистики, дисперсионного, корреляционного и факторного анализа. Описательная статистика проводилась с расчетом средних величин, моды и медианы, что позволяло проверить соответствие распределения выборки нормальному закону. К нормальному распределению относили ту выборку, в которой значения моды, среднего и медианы отличалось не более чем на 5%. При выборке с нормальным распределением дальнейшая проверка статистических гипотез о различиях между группами проводилась с расчетом t-критерия Стьюдента. Преобладающая часть статистических расчетов производились с использованием непараметрических критериев. Сравнение групп и подгрупп пациентов проводили методом рангового однофакторного дисперсионного анализа по Краскелу-Уоллесу (Kruskal-Wallis ANOVA by Ranks) и при помощи медианного теста. В случае выявленной статистической значимости в данных тестах попарное сравнение групп проводили по Манну-Уитни (Mann-Whitney U Test) и по Колмогорову-Смирнову. Сравнение зависимых групп (динамика неврологических и нейро-иммунохимических показателей) осуществляли с использованием рангового дисперсионного анализа по Фридману (Friedman ANOVA) с вычислением коэффициента конкордантности Кендалла (Kendall Coeff. of Concordance). Данные представлены в виде М±m, где М - среднее арифметическое значение, m - стандартная ошибка среднего. При использовании клинических показателей выделялись подгруппы по порядковым качественным и количественным признакам, таким как степень ИБС и СН, выраженность субъективных симптомов и объективных клинических показателей по клиническим шкалам. Для дальнейшего выявления взаимосвязей клинических и иммуно-нейрохимических показателей использовался корреляционный анализ. Корреляционный анализ проводился с использованием метода ранговой корреляции по Спирмену (R) и гамма-корреляции (). Критическое значение уровня статистической значимости (p) при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05.
результаты исследования
БеЛКИ S100b, HLDF и аутоантителА к S100b, HLDF ПРИ гипертонической болезнИ и ЕЕ цереброваскулярных осложнениях
Содержание белка S100b, уровни идиотипических и антиидиотипических аутоантител к S100b в сыворотке крови пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом
Проведено сравнительное изучение количественного содержания S100b, титров АТ и аи-АТ к S100b в сыворотке крови пациентов с ГБ, ГК и ОИИ, а также условно здоровых лиц контрольной группы. В результате проведенных исследований выявлено, что в контрольной группе среднее содержание белка S100b составило 0,57±0,29нг/мл (рис.1а). У пациентов с ГБ и цереброваскулярными осложнениями ГБ концентрация S100b статистически значимо превышала более чем в 15 раз таковую у пациентов контрольной группы и составила 8,6±1,0нг/мл (р<0,0001), 9,0±1,1нг/мл (р<0,0001), 15,9±1,6нг/мл (р<0,0001) при ГБ, ГК и ОИИ соответственно. Наибольшее сывороточное содержание белка S100b, превышающее в 26 раз аналогичный показатель в контрольной группе, выявлено у пациентов с ОИИ, при этом концентрация S100b у них вдвое превышала таковую у пациентов с ГБ (р=0,001) и ГК (р=0,001) (рис.1а).
Обнаружение нейроспецифического белка S100b в крови пациентов с ГБ указывает на нарушение его метаболизма в клетках мозга и/или их повреждение, а также на нарушение проницаемости ГЭБ не только при ЦВЗ, но и при гипертонии, протекающей без церебральных осложнений (Ганнушкина И.В. и др., 2005; Kleindienst A. et al., 2007). Следует отметить, что, согласно литературным данным, циркулирующий в повышенной концентрации S100b может принимать участие в развитии эндотелиальной дисфункции, усиливать адгезию лейкоцитов к эндотелию, способствовать пролиферации гладкомышечных клеток сосудов (особенно в присутствии глюкозы и ангиотензина II), таким образом выступая одним из патогенетических факторов ГБ (Sorci G. et al., 2010).
Выявление повышенного содержания белка S100b при ГБ и ее церебральных осложнениях поставило перед нами задачу изучения у обследуемых пациентов активности гуморального звена иммунитета, а именно - продукции ауто-АТ к белку S100b. Подробное изучение сывороточного уровня данных ауто-АТ у пациентов обследованных групп выявило следующие закономерности. Средний титр АТ к S100b в сыворотке крови условно здоровых лиц составил 1:237±1:211 (рис.1b). У пациентов с ГБ и ее церебральными осложнениями титр идиотипических ауто-АТ к S100b статистически значимо (в 4-12 раз) превышал уровень, выявленный в контрольной группе, и составил при ГБ 1:1033±1:451 (р=0,004), при ГК - 1:1715±1:413 (р=0,014) и при ОИИ - 1:2840±1:1144 (р=0,005). Кроме того, титр АТ к S100b у пациентов с ГК и ОИИ превышал таковой у пациентов с не осложненным течением ГБ в 1,7 (p=0,002) и 2,7 (p=0,001) раз соответственно, при этом наиболее высокий средний титр АТ к S100b наблюдался у пациентов с ОИИ. Обнаруженный повышенный уровень АТ к S100b у пациентов, длительно страдающих ГБ, вероятно, является результатом хронической недостаточности мозгового кровообращения, что может привести к гибели нейронов и глиальных клеток, изменениям в проницаемости ГЭБ с проникновением нейроантигенов в спинномозговую жидкость и кровь и инициации аутоиммунных процессов против S100b и/или проникновению фрагментов ауто-АТ в мозг и связыванию свободного S100b, что в результате ослабляет нейротрофическое звено регуляции с его участием (Скворцова В.И. и др., 2005).
Исследование антиидиотипических (вторичных) ауто-АТ к белку S100b при ГБ и ЦВЗ представляет особый интерес, что обусловлено возможностью выявления не только особенностей функционирования иммунологической сети у обследованных пациентов, но и нарушений нейроиммунных взаимодействий, а также дисбаланса иммунного ответа (Корнева Е.А., 2005; Магаева С.В., Морозов С.Г., 2005; Полетаев А.Б., 2004). При определении уровня аи-АТ к S100b установлено, что в сыворотке крови условно здоровых лиц их средний титр составил 1:185±1:49, в группе с не осложненной ГБ - 1:107±1:4, при ГК - 1:209±1:62, при ОИИ - 1:113±1:7 (рис.2с). Статистически значимых отличий в титрах аи-АТ к S100b у пациентов с ГБ, ГК и ОИИ от контрольной группы выявлено не было. Возможно, это обусловлено начальными стадиями индукции синтеза аи-АТ, либо образованием иммунных комплексов с первичными ауто-АТ. Кроме того, аи-АТ могут не выявляться с помощью используемой методики ИФА в результате их низкой аффинности, которая определяет слабое связывание данных аи-АТ с иммобилизованными на полистироловом планшете АТ к S100b.
Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали, что ГБ, ГК и ОИИ характеризуются 15-26-кратным увеличением сывороточной концентрации белка S100b и 4-12-кратным увеличением титра АТ к S100b по сравнению с контрольной группой. При этом, по сравнению с не осложненной ГБ, ГК характеризуется повышением в 1,6 раз уровня АТ к S100b, а ОИИ сопровождается увеличением концентрации S100b и титра АТ к S100b в 2 и 2,7 раз соответственно.
Содержание белка HLDF, уровни идиотипических и антиидиотипических аутоантител к HLDF в сыворотке крови пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом
Результаты исследования содержания белка HLDF, уровня АТ и аи-АТ к HLDF в сыворотке крови пациентов с диагностированными ГБ, ГК, и ОИИ, а также условно здоровых лиц представлены на рис.2. Установлено, что у пациентов контрольной группы среднее содержание HLDF составило 435,8±21,2нг/мл, в то время как в группах пациентов с ГБ и церебральными осложнениями ГБ оно было статистически значимо снижено более чем в 50 раз: 2,7±0,9нг/мл (р<0,0001) при не осложненной ГБ; 46,4±10,0нг/мл (р<0,0001) при ГК; 51,4±8,4нг/мл (р<0,0001) при ОИИ. Как видно из рис.2а, наименьшая концентрация HLDF, составляющая 0,6% от нормы, выявлена у пациентов с не осложненной ГБ, при этом она была статистически значимо ниже, чем у пациентов с осложненным течением ГБ: в 17 раз по сравнению с ГК (р=0,0003) и в 19 раз по сравнению с ОИИ (р=0,0001).
Выраженное снижение содержания фактора дифференцировки HLDF в сыворотке крови пациентов с ГБ и ее церебральными осложнениями по сравнению с условно здоровыми лицами позволяет предположить вовлеченность HLDF в механизмы регуляции АД на молекулярном уровне. Возможно, данный фактор дифференцировки принимает участие в процессах, контролирующих нормальное функционирование эндотелия и/или других клеток сердечно-сосудистой системы, в частности, в процессах вазоконстрикции, так как при снижении его сывороточной концентрации в организме происходят гипертонические изменения, которые мы наблюдали у пациентов с ГБ, ГК и ОИИ. Объяснением этому эффекту может служить продемонстрированная гемодинамическая активность пептидных фрагментов фактора - HLDF-24 и HLDF-8, а также обнаруженный гомологичный мотив в аминокислотной последовательности HLDF c молекулой эндотелин-превращающего фермента (Ржевский Д.И. и др., 2006). Известно, что развитие ГБ напрямую связано с эндотелиальной дисфункцией (Versari D. et al., 2009; Hirata Y. et al., 2010), в формирование которой, возможно, вовлечен изучаемый фактор дифференцировки и его фрагменты. Учитывая факт обнаружения белка HLDF в структурах мозга (Sewell R.D. et al., 2005), нельзя исключить вовлеченность HLDF в регуляцию АД на уровне центральной нервной системы.
Исследование продукции АТ к белку HLDF у пациентов обследованных групп выявило, что их средний титр в сыворотке крови условно здоровых лиц составил 1:42501:982 (рис.2b). У пациентов с ГБ и церебральными осложнениями ГБ титр АТ к HLDF был статистически значимо ниже в 2-2,5 раз, чем в контрольной группе, и составил 1:1965±1:545 при ГБ (р=0,002), 1:1922±1:592 при ГК (р=0,012), и 1:1698±1:681 при ОИИ (р=0,011). Обнаружено, что титр АТ к HLDF при не осложненном течении ГБ статистически значимо отличался в распределении от титра АТ к HLDF при кризовом течении ГБ согласно тесту Колмогорова-Смирнова (р<0,025).
В результате выявления аи-АТ к HLDF установлено, что в сыворотке крови условно здоровых лиц их средний титр составил 1:23501:800 (рис.2с). Наивысшее значение титра аи-АТ к HLDF среди пациентов обследованных групп выявлено при не осложненной ГБ (1:3509±1:845), однако статистически значимого отличия от контрольной группы не обнаружено. Уровень аи-АТ к HLDF у пациентов с кризовым течением ГБ был в 2,6 раз снижен по сравнению не осложненной ГБ (1:1316±1:293, р=0,032). При этом обнаружено, что титр аи-АТ к HLDF у пациентов с ОИИ выявлялся на уровне 1:2101:74 и был статистически значимо снижен по сравнению с условно здоровыми лицами в 11 раз (р<0,05) и по сравнению с ГК в 6 раз (р=0,0002).