Дипломная (вкр): Определение влияния воды с измененным изотопным составом на функциональные особенности иммунокомпетентных клеток человека

Интерес к лёгкой воде вновь возник лишь в 90-х годах - в связи с широкомасштабными исследованиями, связанными с созданием наиболее благоприятной среды обитания для космонавтов при длительных космических полетах. Было доказано, что лёгкая вода не только улучшает обменные процессы, но и способствует увеличению защитных сил организма.

На Западе интерес к лёгкой воде проявился лишь в 1993 году, когда в экспериментах на опухолевых клетках были обнаружены ее антираковые свойства. Очень много сделал для изучения антираковых свойств лёгкой воды венгерский ученый Г. Шомлаи, который считает ее совершенно новым инструментом субмолекулярной медицины для лечения и предупреждения рака. Следует отметить, что одновременно с зарубежными учеными противоопухолевые свойства лёгкой воды в экспериментах на животных были обнаружены группой ученых под руководством И. Н. Варнавского, работавшего в тесном контакте с учеными Института медико-биологических проблем, руководимых профессором Ю. Н. Синяком. Позднее в НИИ Канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина в экспериментах на мышах, проведенных совместно с Государственным научным центром РФ «Институт медико-биологических проблем, были подтверждены тормозящие эффекты лёгкой воды на рост перевиваемых опухолей и начало опухолевого процесса» [32].

Поразительные результаты были получены и при изучении влияния очищенной, легкой воды на организм человека в Российском научном центре восстановительной медицины. Полученную промышленным путем легкую воду, использовали в лечении больных сахарным диабетом и другими нарушениями обмена веществ. Для достоверности исследования часть пациентов пила обычную питьевую, хотя и хорошего качества. По окончании курса истории болезни этой группы сравнили с другой, получавшей легкую воду. Действие очищенной воды на обмен веществ оказалось комплексным, словно в организме пациента высвобождался скрытый резерв сил, помогающий бороться с возникшими сбоями.

Больным с диагнозом аденокарцинома легкого давали принимать легкую воду непрерывно в течение двух месяцев. За это время прогрессирование болезни не наблюдалось, а опухоль стала меньше [32]. Так же у больных с неоперабельной раковой опухолью простаты после месяца употребления легкой воды опухоль становилась практически незаметной. Действительно, сегодня имеются убедительные доказательства того, что легкая вода может противостоять раку.

Питьевая вода - это сложный по своей структуре и составу продукт, оказывающий полифизиологическое действие на организм человека. Очистка питьевой воды от тяжелых молекул оказывает на организм человека оздоравливающее действие.

В исследовании, проведенном в отделе эндокринологии РНЦ восстановительной медицины и курортологии МЗ РФ, участвовало 50 больных сахарным диабетом 1 и 2 типа. Больные имели сопутствующие заболевания: артериальная гипертония, ишемическая болезнь сердца, ожирение 1-2 степени. Больные принимали легкую воду в течение 28 дней в суточной дозе 1 литр. После курса приема легкой воды у больных сахарным диабетом 1 типа было отмечено статистически достоверное снижение веса больных, гликемии через 1 час после завтрака, суточной гликозурии (в 1,5 раза). Нормализовалось содержание сахара в крови.

У больных сахарным диабетом 2-го типа было отмечено статистически достоверное снижение веса, индекса массы тела, количества жировой ткани. Наметилась тенденция к снижению артериального давления. Из заключения: «Результаты проведенных клинических испытаний свидетельствуют о хорошей переносимости, гипотензивном, гипогликемическом и гиполипидемическом действии легкой воды «Лангвей» при лечении больных сахарным диабетом, особенно типа 2».

Вода - фактор очень важный. Водород входит в молекулы ДНК, так что эффект наследуется.

Самой высокой продолжительностью жизни на территории бывшего СССР отличались жители Кавказа. Это и понятно: целебный воздух гор, здоровое питание, включающее свежие молочные продукты и зелень. Однако самыми большими долгожителями после кавказцев почему-то оказались жители крайнего севера, и с точки зрения прежних представлений о здоровом питании это было совершенно необъяснимо. Исследования природной воды различного происхождения показали, что если содержание тяжелых молекул в обычной воде (как водопроводной, так и бутилированной) соответствует уровню почти 150 ppm, то именно в регионах Севера и Кавказа она отличается более легким составом, а самая легкая вода на планете в природе встречается во льдах Гренландии (около 120 ppm), и в Антарктике (89 ppm). Именно это и является объяснением загадочного факта [33].

На один миллион жителей в среднем в Росии - 8 долгожителей, Чечено-Ингушетии - 353 (Кавказ), в Якутии - 324. Цифры эти объясняются употреблением талых вод. Например, в талой воде высокогорных ледников содержание дейтерия в среднем на 10-12% ниже, чем в обычной, поэтому среди горцев, ее пьющих, так много долгожителей.

В Институте красоты курс лечения с применением легкой воды прошли пациентки экспериментальной группы. У них быстрее, чем у остальных, нормализовался обмен веществ, они в более короткие сроки теряли лишний вес. Кроме того, на проблемные участки кожи пациентам наносили специальные маски на основе легкой воды - и гнойнички, угри, экзема проходили быстрее, чем у тех, кто применял классические косметические средства. Более ярко были выражены регенерация тканей, омолаживающий и увлажняющий эффект. Хорошо известно, что необходимая человека энергия накапливается в клетках в виде особых молекул (АТФ). Исследования показали: применение легкой воды увеличивает уровень АТФ на 30%. Все клетки организма чувствуют прилив энергии - это отражается на цвете лица, блеске волос и тонусе кожи. Повышается иммунитет, препятствуя развитию воспалительных реакций, которые, как известно, являются одной из главных причин преждевременного старения.

2. Экспериментальная часть

В данной работе исследовалось влияние воды с пониженным содержанием дейтерия (40±2ppm) на функциональные свойства иммунокомпетентных клеток крови человека (лимфоцитов). Для этого определялось количество однонитевых разрывов ДНК в лизатах лимфоцитов, выделенных из цельной крови здоровых доноров и больных с врожденными пороками развития челюстно-лицевой области (ВПР ЧЛО). Предварительно клетки инкубировали в физиологическом растворе на легкой (экспериментальные образцы) и обычной воде (контрольные образцы). Однонитевые разрывы ДНК являются начальным этапом фрагментации молекулы ДНК и предшествуют переходу клетки в состояние апоптоза (гибели).

Так же было определено содержание дейтерия в питьевой воде различных районов города Краснодара.

Воду с пониженным содержанием дейтерия производили на установке ЛВ-1 [34] в Бизнес-инкубаторе Кубанского государственного университета.

Определение концентрации дейтерия в полученной воде были проведены на импульсном ЯМР спектрометре JEOL JNM-ECA 400MHz в центре коллективного пользования "Диагностика структуры и свойств наноматериалов" КубГУ по методике, изложенной в работе [35].

2.1 Определение содержания дейтерия в питьевой воде

Для определения изотопного состава использовался ЯМР спектрометр. Физические основы спектроскопии ядерного магнитного резонанса определяются магнитными свойствами атомных ядер. Взаимодействие магнитного момента ядра с внешним магнитным полем В0 приводит в соответствии с правилами квантовой механики к диаграмме ядерных энергетических уровней, так как магнитная энергия ядра может принимать лишь некоторые дискретные значения Ei, - так называемые собственные значения. Этим собственным значениям энергии соответствуют собственные состояния - те состояния, в которых только и может находиться элементарная частица. Они также называются стационарными состояниями. С помощью высокочастотного генератора можно вызвать переходы между собственными состояниями на диаграмме энергетических уровней. Поглощение энергии можно обнаружить, усилить и записать как спектральную линию, или так называемый резонансный сигнал (рисунок 1).

а - образец в магнитном поле В0; б - диаграмма энергетических уровней; в - резонансный сигнал

Рисунок 1 - Получение спектральной линии методом ЯМР

Определение концентрации дейтерия пробах питьевой воды были проведены на импульсном ЯМР спектрометре JEOL JNM-ECA 400MHz. Съёмка спектров проводилась на соответствующей резонансной частоте ядер дейтерия - 61,4 MГц. Параметры съёмки: 6,7 с (acquisition time), 20 с (relaxation delay), 5,6 мкс (x-pulse), 0,15 Гц (resolution). Температура съёмки - 25 ◦C, при этом точность стабилизации 0,2 ◦C. Измерения проводились с использованием 5 мм ампулы, внутри которой был строго зафиксирован запаенный капилляр, содержащий откалиброванную в определяемой концентрационной шкале смесь дейтерированного и недейтерированного диметилсульфоксида (DMSO), дающего 2D ЯМР сигнал в области 3,4 м.д. (относительно Si(СD3)4), в то время как 2D ЯМР сигнал HDO находится в области 4,7 м.д. (относительно Si(СD3)4).

Обработка полученных спектров заключалась в определении соотношения интегральных интенсивностей 2D ЯМР сигнала HDO, содержащейся в исследуемом образце относительно 2D ЯМР сигнала DMSO-D1, интенсивность которого, в свою очередь, была определена при таких же условиях относительно стандартов - образцов воды с точно определённым содержанием дейтерия (8,2 мг/л, 110,5 мг/л, 332 мг/л). Измерения каждого образца проводились неоднократно для уменьшения погрешностей эксперимента.

В таблице 1 приведены результаты определения содержания дейтерия в пробах воды питьевой, взятой из разных районов г. Краснодара.

Таблица 1 - Результаты определения содержания дейтерия в пробах питьевой воды г. Краснодара

Из таблицы 1 видно, что во всех пробах питьевой воды содержание дейтерия находится на одном уровне 152 ± 3 ppm, что соответствует его содержанию в природной воде.

.2 Выявление и выделение лимфоцитов из цельной крови человека

Для определения наличия и концентрации иммунокомпетентных клеток в донорской крови, использовался счетчик форменных элементов крови «Пикоскель ПС-4М». Данный счетчик используется в медицинской практике для счета форменных элементов крови: числа эритроцитов, лейкоцитов, и тромбоцитов.

Для «Пикоскеля ПС-4М» наиболее важными техническими характеристиками являются:

определяемая концентрация форменных элементов крови от 2·103 до 105 см-3;

определяемые размеры форменных элементов от 2 до 12 мкм;

систематическая погрешность не более 15 %;

случайная погрешность не более 4%;

время измерения одной пробы не более 40 с.

Работа счётчика форменных элементов крови «Пикоскель ПС-4М» построена на принципе измерения импеданса и реализована на счёте электрических импульсов, вызванных исследуемыми частицами, проходящими через отверстие измерительной трубки. Исследуемые частицы помещаются с помощью дозирующих устройств в электропроводящую жидкость (электролит), который совместно с ними представляет собой вид суспензии.

При запуске цикла измерения в измерительной трубке возникает вакуум, под действием которого находящиеся в электролите частицы засасываются в измерительную трубку через отверстие. Когда уровень суспензии внутри измерительной трубки достигает первого внутреннего электрода, между ним и внешним электродом протекает постоянный по величине измерительный ток. Электрическое сопротивление между электродами значительно изменяется каждый раз, когда через отверстие измерительной трубки проходят частицы с электропроводимостью, отличающейся от электропроводимости электролита. Изменение сопротивления создает импульсы напряжения. Подключенный к электродам регистрирующий узел может определить концентрацию частиц. Когда внутри измерительной трубки уровень суспензии достигает второго внутреннего электрода, в измерительной трубке создаётся давление, под действием которого тот же самый объём суспензии из неё выталкивается и, находящиеся в нём частицы, снова проходят через измерительную трубку.

Подсчёт частиц всегда происходит в постоянном объёме измерительной трубки, ограниченном первым и вторым внутренними электродами. По окончании цикла измерения результаты счёта можно снять с дисплея счётчика или распечатать.

Для определения значения фона. Была установлена измерительная трубка, затем в измерительный стакан налили 10 мл чистого физиологического раствора с последующим добавлением трех капель гемолитика. Далее стакан с физиологическим раствором был установлен на столик. После был выбран режим для измерения лейкоцитов при измерительном токе 200 мкА. Значение фона составило 0,7·109 шт/л.

Для подсчета частиц крови одинаково пригодна кровь, взятая из вены в пробирку (цельная), а так же проба крови, взятая из кончика пальца (периферическая).

Для проведения данного опыта была использована цельная кровь, отобранная у здоровых и больных (ВПР ЧЛО) доноров.

Проведение измерения числа лейкоцитов производилось следующим образом. Измерительная трубка была установлена на 100 мкм, затем был выбран режим счета лейкоцитов WBC, с последующим выбором тока 200 мкА. Далее разбавляем кровь физиологическим раствором в пропорции 1:630 (16 мкл крови на 10 мл физиологического раствора) и добавляем три капли гемолизируюющего раствора (гемолитика). Спустя три минуты полученный раствор был установлен на измерительный столик и производим счет лейкоцитов.

Были определено, что в одном литре крови доноров содержится 4,6·109 штук лейкоцитов. Лимфоциты составляют 28% от общего числа лейкоцитов, следовательно, их концентрация 1,288·109шт/л.

Для выделения лимфоцитарной массы из цельной крови была использована методика [36]. Метод основан на разделении клеток крови при центрифугировании в градиенте плотности фиколла-урагрофина.

За сутки до выделения лимфоцитов из цельной крови, необходимо приготовить раствор фиколла-урографина с плотностью 1,093 г/мл. Раствор фиколла-урографина готовился следующим образом: в небольшом количестве дистиллированной теплой воды растворили 4,1 г фиколла 400, добавили 10 мл 76 % урографина и добавили дистиллят. Приготовленный раствор оставили на сутки. На следующий день довели водой до нужной плотности. Плотность раствора измеряли с помощью ареометра.

Для каждого исследуемого образца промаркировали по два эппендорфа вместимостью 1,5 мл - A и B. В пробирки, маркированные A, внесли с помощью дозатора по 500 мкл 0,9 % раствора NaCl стерильного, а затем таким же образом, поместили 500 мкл цельной крови и аккуратно смешали кровь с физраствором, тем самым стабилизировав кровь.

В эппендорфы, маркированные В, стерильных, внесли по 500 мкл фиколл-урографина. На фиколл-урографин аккуратно, избегая смешивания, наслаивали стабилизированную кровь, а затем, закрыв эппендорфы, поместили их в центрифугу Sigma 1-14 на 20 мин при скорости вращения равной 400 об/мин. По истечению 20 мин, содержимое эппендорфа представляло собой следующий гетерофазный раствор. На дно выпадал осадок красного цвета из эритроцитов и тромбоцитов, т. к. их плотность выше плотности фиколла-урографина. Надосадочная жидкость разделилась на две фазы: прозрачная - фиколл-урографин и красная жидкость, представляющая собой плазму крови. На границе раздела этих двух фаз образовалось кольцо из бело-желтых сгустков, содержащее лимфоциты. С помощью микродозатора производился сбор межфазного кольца, содержимое которого было помещено в отдельный стерильный эппендорф для дальнейшей отмывки клеток от примесей. Для отмывки клеток был добавлен физраствор в количестве 500 мкл, а затем эппендорфы снова были помещены в центрифугу на 10 мин со скоростью вращения 400 об/мин. После этого отбирали надосадочную жидкость. Выделенные лимфоциты цельной крови можно хранить при температуре минус 20 0С. На рисунке 2 представлена фотография выделенных лимфоцитов.