Реферат
Дипломная работа 64 с., 7 рис., 1 табл., 38 источников.
ДЕЙТЕРИЙ, ЛЕГКАЯ ВОДА, ИМУНОКОМПЕТЕНТНЫЕ КЛЕТКИ, ЛИМФОЦИТЫ, АПОПТОЗ КЛЕТОК, РЕПАРАЦИЯ ДНК, ФЛУОРИМЕТРИЯ
Объектом исследования данной дипломной работы являлись ДНК лимфоцитов, выделенные из цельной крови здоровых доноров и больных с врожденными пороками развития челюстно-лицевой области.
Целью работы являлось определение влияния воды с измененным изотопным составом на функциональные особенности иммунокомпетентных клеток человека (определение процентного содержания однонитевых разрывов ДНК).
В результате выполнения дипломной работы были
получены данные о влиянии воды с пониженным содержанием дейтерия на
жизнеспособность иммунокомпетентных клеток in
vitro для здоровых лиц и
больных с врожденными пороками развития челюстно-лицевой области.
СОДЕРЖАНИЕ
Введение
. Литературный обзор
.1 Иммунитет и иммунокомпетентные клетки человека
.2 Апоптоз клеток
.3 Молекула ДНК
.3.1 Химическая структура ДНК
.3.2 Характер и типы повреждений ДНК
.3.3 Репарация ДНК
.4 Свойства изотопов водорода
.5 Влияние воды с измененным изотопным составом на биологические объекты
.5.1 Влияние тяжелой воды на биологические объекты
.5.2 Влияние лёгкой воды на биологические объекты
. Экспериментальная часть
.1 Определение содержания дейтерия в питьевой воде
.2 Выявление и выделение лимфоцитов из цельной крови человека
.3 Инкубирование лимфоцитов в воде с измененным изотопным составом и определение однонитевых разрывов ДНК
.4 Изучение влияния воды с измененным изотопным составом на состояние ДНК лимфоцитов
Заключение
Список использованных источников
введение
Вода является основой жизнедеятельности организма. Живые организмы на 65-70% состоят из воды. Важным показателем качества воды является ее изотопный состав. Природная вода на 99,7% состоит из протия и кислорода-16. Оставшиеся 0,3% представлены изотопными разновидностями молекул воды. Научно доказано, что природная вода с пониженным содержанием тяжелых изотопов водорода и кислорода обладает стимулирующими и лечебными свойствами, то есть живая клетка реагирует даже на небольшое изменение содержания тяжелых изотопов в воде. Снижение концентрации тяжелой воды даже на 2-3% резко увеличивает биостимулирующие свойства воды.
Одним из самых важных и наиболее интересующих нас в этой работе изотопов водорода является дейтерий. Как оказалось, содержание его в воде напрямую сказывается на жизненно важных свойствах воды и влияет на обменные процессы в живых организмах. Поскольку последнее время остро стоит проблема минимизации отрицательного влияния внешних факторов на физическое благополучие человека, изучение дейтерия и уменьшение его содержания в воде ежедневного использования является одной из перспективнейших и важнейших экологических задач на сегодняшний момент.
Изучение возможных механизмов влияния изотопного состава воды на работу биологических систем показало их сложность и разнообразие. Высказаны предположения о воздействии дейтерия на системы водородных связей, обеспечивающие структуру и функции макромолекул. При инкубации клеток в воде с измененным относительно первоначального соотношением D/H, изменяется не только соотношение дейтериевой и протиевой воды внутри биологической системы как растворителя, но также осуществляется изотопный обмен в гидроксильных, сульфгидрильных, карбоксильных и аминогруппах молекул всех органических соединений.
Вода с пониженным содержанием дейтерия оказывает стимулирующее действие на живые системы, существенно повышает их активность, жизнестойкость к различным негативным факторам, репродуктивную деятельность, улучшает и ускоряет обмен веществ.
В настоящее время значительное развитие получили исследования биологических эффектов воды с пониженным содержанием дейтерия. Ее положительные свойства и успешное использование в качестве вещества, влияющего на скорость протекания химических реакций, сольватации и подвижности ионов, позволяют предположить ее благоприятное действие на клеточные структуры иммунокомпетентных клеток для предотвращения их неконтролируемого массового апоптоза.
Многочисленные данные по изучению функционального статуса системы лимфоцитов, основной в клеточном отношении клеточной популяции периферической крови, оснащенной мощными микробицидными и цитотоксическими механизмами, является основанием для изучения роли данных клеток в патогенезе различных патологий, сопряженных с цитолитическим процессом. Лимфоциты являются источником активных форм кислорода, осуществляют первую линию защиты и от их хемотаксической, фагоцитарной и метаболической активности во многом зависит состояние иммунной системы и организма в целом.
Целью работы являлось исследование влияния воды с измененным изотопным составом на функциональные особенности иммунокомпетентных клеток человека.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
изучение литературы, посвященной воздействию воды с измененным изотопным составом на живые системы;
выделение лимфоцитов из цельной крови человека в норме и патологии;
инкубирование лимфоцитов в физиологическом растворе, приготовленном на воде с различным изотопным составом;
лизирование клеток, моделирование однонитевых разрывов ДНК и определение их процентного содержания флуориметрическим методом;
изучение влияния воды с измененным изотопным
составом на состояние ДНК лимфоцитов.
1. Литературный обзор
.1 Иммунитет и
иммунокомпетентные клетки человека
Иммунитет - невосприимчивость, сопротивляемость организма к инфекциям и инвазиям чужеродных организмов (в том числе - болезнетворных микроорганизмов), а также воздействию чужеродных веществ, обладающих антигенными свойствами. Иммунные реакции возникают и на собственные клетки организма, измененные в антигенном отношении [1].
Биологический смысл иммунитета - обеспечение генетической целостности организма на протяжении его индивидуальной жизни. Развитие иммунной системы обусловило возможность существования сложно организованных многоклеточных организмов[2].
Иммунитет делится на врождённый и приобретенный.
Врождённый (неспецифический, конституционный) иммунитет обусловлен анатомическими, физиологическими, клеточными или молекулярными особенностями, закрепленными наследственно. Как правило, не имеет строгой специфичности к антигенам, и не обладает памятью о первичном контакте с чужеродным агентом [2].
Приобретенный иммунитет делится на активный и пассивный.
Приобретенный активный иммунитет возникает после перенесенного заболевания или после введения вакцины.
Приобретенный пассивный иммунитет развивается при введении в организм готовых антител в виде сыворотки или передаче их новорожденному с молозивом матери или внутриутробным способом.
Также иммунитет делится на естественный и искусственный.
Естественный иммунитет включает врожденный иммунитет и приобретенный активный (после перенесенного заболевания), а также пассивный при передаче антител ребёнку от матери.
Искусственный иммунитет включает приобретенный активный после прививки (введение вакцины) и приобретенный пассивный (введение сыворотки).
Выделяют центральные и периферические органы иммунной системы. К центральным органам относят красный костный мозг и тимус, а к перифрическим - селезенку, лимфатические узлы, а также местноассоциированную лимфоидную ткань: бронхассоциированную, кожноассоциированную, кишечноассоциированную [3].
Красный костный мозг - центральный орган кроветворения и иммуногенеза. Содержит самоподдерживающуюся популяцию стволовых клеток. Красный костный мозг находится в ячейках губчатого вещества плоских костей и в эпифизах трубчатых костей. Здесь происходит дифференцировка В-лимфоцитов из предшественников. Содержит также Т-лимфоциты.
Тимус - центральный орган иммунной системы. В нем происходит дифференцировка Т-лимфоцитов из предшественников, поступающих из красного костного мозга.
Лимфатические узлы - периферические органы иммунной системы. Они располагаются по ходу лимфатических сосудов. В каждом узле выделяют корковое и мозговое вещество. В корковом веществе есть В-зависимые зоны и Т-зависимые зоны. В мозговом есть только Т-зависимые зоны.
Селезёнка - паренхиматозный зональный орган. Является самым крупным органом иммунной системы, кроме того, выполняет депонирующую функцию по отношению к крови. Селезёнка покрыта капсулой из плотной соединительной ткани, которая содержит гладкомышечные клетки, позволяющие ей при необходимости сокращаться. Паренхима представлена двумя функционально различными зонами: белой и красной пульпой. Белая пульпа составляет 20 %. Представлена лимфоидной тканью. Здесь имеются В-зависимые и Т-зависимые зоны. И также здесь есть макрофаги. Красная пульпа составляет 80 % [3]. Она выполняет следующие функции:
депонирование зрелых форменных элементов крови;
контроль состояния и разрушения старых и повреждённых эритроцитов и тромбоцитов;
фагоцитоз инородных частиц;
обеспечение дозревания лимфоидных клеток и превращение моноцитов в макрофаги;
Иммунокомпетентные клетки - это клетки, входящие в состав иммунной системы. Все эти клетки происходят из единой родоначальной стволовой клетки красного костного мозга. Все клетки делятся на 2 типа: гранулоциты и агранулоциты. К гранулоцитам относят нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. К агранулоцитам: макрофаги и лимфоциты (B, T).
Нейтрофилы - это неделящиеся и короткоживущие клетки. Они составляют 95 % от гранулоцитов. Нейтрофилы содержат огромное количество антибиотических белков, которые содержатся в различных гранулах. К этим белкам относятся лизоцим (мурамидаза), липопероксидаза и другие антибиотические белки. Нейтрофилы способны самостоятельно мигрировать к месту нахождения антигена, так как у них есть рецепторы хемотаксиса (двигательная реакция на химическое вещество). Нейтрофилы способны «прилипать» к эндотелию сосудов и далее мигрировать через стенку к месту нахождения антигенов. Далее проходит фагический цикл, и нейтрофилы постепенно заполняются продуктами обмена. Далее они погибают и превращаются в клетки гноя [4].
Эозинофилы составляют 2-5 % от гранулоцитов. Способны фагоцитировать микробы и уничтожать их. Но это не является их главной функцией. Главным объектом эозинофилов являются гельминты. Эозинофилы узнают гельминтов и экзоцитируют в зону контакта вещества - перфорины. Эти белки встраиваются в билипидный слой клеток гельминта. В них образуются поры, внутрь клеток устремляется вода, и гельминт погибает от осмотического шока.
Базофилы составляют меньше, чем 0,2 % от гранулоцитов. Существуют две формы базофилов: собственно базофилы - базофилы, циркулирующие в крови и тучные клетки - базофилы, находящиеся в ткани. Тучные клетки располагаются в различных тканях, лёгких, слизистых и вдоль сосудов. Они способны вырабатывать вещества, стимулирующие анафилаксию (расширение сосудов, сокращение гладких мышц, сужение бронхов). При этом происходит взаимодействие с иммуноглобулином. Таким образом они участвуют в аллергических реакциях. В частности, в реакциях немедленного типа.
Моноциты превращаются в макрофаги в селезёнке. Макрофаги профессиональные и антогенпрезентирующие [4].
Главная функция профессиональных макрофагов - обеспечить фагоцитарную защиту от микробной инфекции. Также они способны фагоцитировать повреждённые клетки организма, в том числе клетки крови. Макрофаги секретируют цитокины, привлекающие нейтрофилы и эозинофилы к месту нахождения антигенов.
Роль антигенпрезентирующих макрофагов - поглощение микробов и представление их Т-лимфоцитам. Макрофаги принимают участие в иммунном ответе на всех его этапах.
Натуральные киллеры (NK-клетки) - незрелые Т-лимфоциты, обладающие цитотоксичной активностью, то есть они способны: прикрепляться к клеткам-мишеням, секретировать токсичные для них белки, убивать их или отправлять в апоптоз. Натуральные киллеры распознают клетки, поражённые вирусами и опухолевые клетки.
Макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и натуральные киллеры обеспечивают прохождение врождённого иммунного ответа, который является неспецифичным.
Свою основную функцию иммунная система осуществляет через развитие специфических (иммунных) реакций, в основе которых лежит способность распознавания своего и чужого и последующая элиминация чужеродного. Появляющиеся в результате иммунной реакции специфические антитела составляют основу гуморального иммунитета, а сенсибилизированные лимфоциты являются основными носителями клеточного иммунитета [2].
Работа иммунной системы характеризуется высокой специфичностью реакций и существованием феномена «иммунологической памяти».
Специфичность иммунных реакций проявляется в
том, что на антиген А вырабатывается антитела или клетки анти-А, которые ни с
каким другим антигеном не взаимодействуют, а на антиген В вырабатываются только
антитела или клетки анти-В. Феномен «иммунологической памяти» характеризуется
тем, что повторный контакт с антигеном вызывает ускоренное и усиленное развитие
иммунного ответа, что обеспечивает более эффективную защиту организма по
сравнению с первичной иммунной реакцией [2]. Эта особенность вторичной иммунной
реакции лежит в основе смысла вакцинации, которая успешно защищает от
большинства инфекций. Следует отметить, что иммунные реакции не всегда
выполняют только защитную роль, они могут быть причиной иммунопатологических
процессов в организме и обусловливать целый ряд соматических заболеваний
человека.
1.2 Апоптоз клеток
иммунитет изотоп водород кровь
Апоптоз и некроз - два разных механизма отмирания индивидуальных клеток тканей, органов человека и животных. Эти варианты характеризуются различными морфологическими и молекулярными явлениями и разным влиянием на окружающие ткани.
Апоптоз - форма гибели клеток в многоклеточном организме вследствие реализации программы, приводящей к поэтапному прекращению его жизнедеятельности. При апоптозе в клетке наблюдаются характерные молекулярные проявления, приводящие к цитологическим изменениям, которые характеризуются уменьшением ее размера, сморщиванием цитоплазматической мембраны, переходом фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой, конденсацией и фрагментацией ядра (кариопикноз и кариорексис), фрагментацией ДНК хромосом. Затем вследствие распада ядра и цитоплазмы формируются апоптические мембраносвязанные тельца с внутриклеточным содержимым, которые в последующем подвергаются фагоцитозу [5].
Другая форма гибели клетки - некроз возникает как патологический процесс в результате воздействия на нее внешнего повреждающего фактора. Синоним термина некроз - «гибель клетки от повреждения». Одним из основных механизмов гибели клетки вследствие некроза является повреждение ее плазматической мембраны, лизис, что приводит к нарушению ее ионного состава, набуханию мембранных органелл, разрыву лизосомальных мембран и, как следствие, деструкции цитоплазматических структур. Во внеклеточном пространстве продукты деструкции некротических клеток вызывают воспалительный процесс. В дальнейшем клеточный детрит поглощается фагоцитами [5]. Обычно некроз характерен для нескольких клеток, формирующих группы, в то время как апоптоз может наблюдаться в одной клетке.