Не все мутагенные факторы, вызывают однотипные изменения в молекулах ДНК. Одни из них приводят к замене оснований, другие - к сдвигу порядка считывания кодонов, третьи - более эффективно разрывают углеводно-фосфатный остов в молекулах ДНК и т. д.
Наиболее полно молекулярные механизмы мутагенного действия выяснены для аномальных нуклеотидов и азотистой кислоты [18]. Мутагенное действие аномальных оснований появляется в замене одной пары нуклёотидов на другую. Это возможно по следующим причинам. Каждое азотистое основание может находиться в одной из двух возможных для него таутомерных форм: в одном случае кетонной или энольной, в другом - аминной или иминной. Так, аденин и гуанин чаще находятся в амино-форме, а цитозин с тимином - в кето-форме. Довольно редко имеет место спонтанный переход одной формы основания в другую. При этом переход аденина из амино- в имино-форму влечет за собой изменения спаривания этого основания. В новой форме аденин спаривается не с тимином, а с гуанином. В следующем акте репликации гуанин, как положено, образует пару с цитозином. В итоге в определенном месте ДНК пара А - Т будет заменена на пару Г - Ц. Такие замены возможны спонтанно и с другими основаниями, что является одной из причин спонтанных мутаций. Аномальные основания с большей частотой претерпевают таутомервые превращения и поэтому частота мутаций при внесении их в клетки возрастает.
Азотистая кислота не является азотистым основанием. Но она способна реагировать с азотистыми основаниями, вызывая дезаминирование последних. При этом аденин превращается в аномальное основание гипоксантин, а цитозин - в урацил. Гипоксантин спаривается с цитозином, вследствие чего происходит замена пары А - Т на Г - Ц, а урацил, как известно, спаривается с аденином, вследствие чего произойдет замена пары Г - Ц на А - Т.
Алкилирующие агенты, обладают способностью
передавать азотистым основаниям имеющуюся у них метильную или этильную группу.
В результате возникают модифицированные основания с измененной способностью к
образованию водородных связей, что обусловливает уже описанные эффекты. Но
алкилирующие агенты обладают и другим механизмом мутагенного действия. Они
способны разрывать связь гуанина и аденина с дезоксирибозой, что приводив к выпадению
основания. На место выпавшего основания может по ошибке включиться другое и
вызвать мутацию. Кроме того, алкилирующие агенты способны разрывать
углеводно-фосфатный остов ДНК» что вызывает различные перестройки хромосом.
1.3.3 Репарация ДНК
Повреждение ДНК может приводить к появлению мутаций, провоцировать гибель клетки или служить толчком к ее злокачественному перерождению [19]. Для предотвращения таких последствий в клетке существует несколько взаимодополняющих ферментативных систем, которые поддерживают процессы, носящие общее название репарация ДНК. Главная цель всех этих систем - восстановление последовательности ДНК, существовавшей до ее повреждения, или, если это невозможно, сведение изменений к минимуму. Системы репарации ДНК обеспечивают точность воспроизведения и сохранения генетической информации. Осуществляется специальными ферментными системами клетки.
Обычно рассматривают три основных механизма репарации: фоторепарацию (фотореактивацию), эксцизионную репарацию и пострепликативную репарацию.
Эксцизионная репарация заключается в узнавании повреждения ДНК, вырезании (эксцизии) повреждённого участка, ресинтезе ДНК по матрице интактной цепочки и восстановлении непрерывности цепи ДНК.
Пострепликативная репарация включается в тех случаях, когда эксцизионная репарация не справляется с устранением всех повреждений, возникших в ДНК до её репликации. В этом случае воспроизведение повреждённых молекул приводит к появлению молекул с однонитевыми пробелами, а нативная структура восстанавливается с использованием этапа рекомбинации. Ферменты репарации принимают участие в редупликации и рекомбинации, а также в мутационном процессе [20]. В последнем случае в клетке работает особый тип индуцибельной репарации, склонной к ошибкам. В результате происходит восстановление нативной структуры ДНК, однако, с искажением заключённой в ней генетической информации.
Считается, что нарушение механизмов репарации
ДНК в целом приводит к различным патологическим процессам, в число которых
входят канцерогенез, дефекты развития и старение. На сегодняшний день известен
ряд наследственных заболеваний, причиной которых служат нарушение репарации
ДНК. Дефекты системы эксцизионной репарации нуклеотидов приводят к
возникновению пигментной ксеродермы, синдрома Кокейна и трихотиодистрофии [21].
Наследственный неполипозный рак толстой кишки может вызываться мутациями
некоторых генов системы репарации гетеродуплексов. Многие синдромы
предрасположенности к онкологическим заболеваниям - ретинобластома , семейный
аденоматозный полипоз и т.п. - связаны с нарушениями систем ответа на
повреждение ДНК.
1.4 Свойства изотопов
водорода
Водород представляет собой смесь трех изотопов: легкий изотоп протий, затем тяжелые изотопы - дейтерий и тритий. Содержание трития в природе ничтожно. Но дейтерий - небольшая, но постоянная примесь к протию, обращает на себя внимание.
Распространенность дейтерия в природе настолько мала, что он долгое время «прятался» от исследователей, маскируясь под ошибки опытов, недостаточную точность измерений. Лишь в 1931 г. К. М. Бэрдж и Г. И. Мендель, сопоставляя значения атомного веса водорода, определенные химически и масс-спектрографически (1,00777 ±0,00002 и 1,00756±0,00015), нашли, что разницу между этими значениями объяснить ошибкой опытов нельзя. Ученые пришли к выводу о существовании тяжелого изотопа с атомным весом 2. Они вычислили и изотопное отношение - приблизительно 1 : 4700 [22].
Следующим этапом была основополагающая работа П. Юри, Г. Бриккуэдда. Они испаряли большие количества жидкого водорода и собирали газ из фракции последнего кубического сантиметра. Спектральным анализом в этом газе были обнаружены линии спутники ряда характерных водородных линий (Нβ, Нγ, Нδ); спутники соответствовали теоретически вычисленным длинам волн для тяжелого изотопа с точностью до 0,02 А. Отношение изотопов по расчету равно 1 : 4000. Позднее были исследованы пробы водорода самого различного происхождения: из кратера Килауэа, из обсидиана, из девонских отложений, из природного газа, содержащего гелий - везде результат был один и тот же [23].
В 1933 г. Дж. Льюис сообщил, что после разделения воды электролизом ему удалось получить воду с удельным весом 1,035, т. е. воду, в которой содержание тяжелой фракции составляло одну треть. Получив тем же способом 0,12 см3 99,99 % тяжелой воды, он тщательно исследовал и определил некоторые ее физические свойства. В том же 1933 г. О. Уошберн первым высказал мысль, что любые аспекты изучения тяжелого изотопа могут быть весьма интересными. Можно было ожидать, что изотопы водорода обнаружат значительное различие в химическом поведении и это откроет новый большой кругозор в химии и биологии [23].
Со времени открытия дейтерия прошло 42 года. Дейтерий и его соединения за это время изучены, пожалуй, лучше многих других элементов таблицы Менделеева, так как на тяжелую воду возник промышленный спрос. Изучено влияние дейтерия на жизнедеятельность организмов: выяснено, что в больших концентрациях для высших растений и животных - это яд [24].
Содержание дейтерия в воде Мирового океана принято за норму. В морской воде на каждый атом дейтерия приходится 6800 атомов протия, что составляет 0,015 атом.%, или 0,017 вес.%. Материковые воды содержат дейтерия меньше: 0,0135 атом.%, или 0,015 вес.%. Много это или мало? Совсем немного, если сравнивать кларк дейтерия с кларками таких распространенных в природе элементов, как кислород, кремний, железо. Но это совсем не мало, если рассматривать дейтерий в воде и организмах в качестве микроэлемента. Тогда ему следует отвести одно из первых мест среди других микроэлементов.
На ничтожные концентрации дейтерия как на активный фактор жизни никто сначала не обращал внимания. Приоритет принадлежит советскому ученому Б. Н. Родимову [25]. Позже этим вопросом стали заниматься другие ученые в нашей стране и за рубежом - в США, Бразилии, Мексике и других странах.
Что же обнаружено при этих исследованиях? Оказывается, даже частичное удаление дейтерия из обычной воды превращает ее в активный стимулятор жизни. Отсюда вытекает очень важное следствие: дейтерий вреден организмам при любой его концентрации, даже при такой, в какой он находится в обычной воде, а следовательно, и в любом живом организме.
Вода - самое распространенное соединение водорода в природе, среда для многих организмов, их главная составная часть. И она тоже на 2/3, как и организмы, состоит из атомов водорода и только на 1/3 из атомов кислорода. Изменение изотопного состава воды, поглощаемой организмом, влечет за собой изменение соотношения тяжелого и легкого водорода в живых тканях. Так, при удалении из обычной воды только части от входящей в ее состав небольшой примеси дейтерия содержание его в организме тоже снижается, что служит стимулом, активизатором жизнедеятельности организма.
К сожалению, для выяснения механизма такого стимулирования, а значит, роли и поведения дейтерия в биохимических процессах сделано очень мало, хотя современное состояние биохимии дает возможность исследовать эти процессы на молекулярном и даже субмолекулярном уровне.
Толчком к развитию биохимии дейтерия должно послужить еще одно важное обстоятельство. Дело в том, что обменные процессы нашей планеты с космосом ведут к систематическому накоплению дейтерия в Мировом океане. В прошедшие эпохи его было меньше, в будущем станет больше. Опыты по воздействию на организмы пониженного и повышенного содержания дейтерия в поглощаемой воде свидетельствуют о беззащитности организмов по отношению к дейтерию.
Не следует ли из всего сказанного, что вода при условии сдвига ее изотопного состава в сторону уменьшения дейтерия может стать одной из основ развития и процветания жизни? Такая вода на нашей планете есть. Изучение процессов кругооборота воды в природе показывает, что заметное расхождение в свойствах тяжелого и легкого изотопов обусловливает разницу в поведении тяжелой и легкой воды. В результате в природе все время происходит сегрегация изотопов водорода. В зависимости от атмосферных и географических условий выпадающие осадки отличаются большим или меньшим содержанием дейтерия. Для некоторых зон и регионов Земли характерны осадки, в значительной мере освобожденные от дейтерия. Это природные источники стимулирующей жизнь воды. Их надо суметь найти и сберечь. Разумное использование этих живительных источников в сельском хозяйстве, по-видимому, поможет расширить кормовые и пищевые ресурсы человечества, в медицине же они могут оказаться весьма эффективным лечебным средством.
В наши дни возрождена старая, одно время забытая, теория абсорбции газовых молекул на поверхности твердых тел. Молекулы удерживаются на ионных (электрически заряженных) поверхностях благодаря несбалансированности электрических полей этих поверхностей. Мощные электростатические поля притягивают и удерживают одни молекулы прочнее, чем другие, в результате чего и происходит разделение двух разновидностей протия, идентичных во всем, кроме величины вращательной энергии молекул [25]. Некоторые органические соединения устойчивы только тогда, когда они построены из какой-либо одной разновидности атомов протия. Именно этим обстоятельством можно объяснить получение Ларком энзима полимеразы ДНК с десятикратно увеличенной длиной цепи синтетических полинуклеотидов [26].
Таким образом, даже тонкие различия в степени возбуждения электрона протия изменяют его химические свойства. А ведь атомы протия и дейтерия отличаются друг от друга гораздо сильнее, чем атомы протия разной степени возбуждения.
В процессах водородного обмена дейтерий замещает в молекулах соединений лишь определенные атомы водорода. Так, в уксусной кислоте он занимает место активного водорода карбоксильной группы, но не входит в метильную группу. При растворении сахара в тяжелой воде подвижный водород сахара немедленно замещается дейтерием. При адсорбции молекул тяжелой воды поверхностью микропористого стекла происходит дейтерирование с образованием групп Si - OD; этот процесс вполне аналогичен гидрированию. Характерно, что при обменных реакциях дейтрон присоединяется не только к электронной паре атома кислорода или азота, что типично для водорода, но и к атому углерода, т. е. замещает даже менее активные в этом отношении атомы водорода [22].
Фенол и его эфиры при растворении в жидком бромистом дейтерии при комнатной температуре сразу же обменивают три атома водорода в каждом из колец, но дальше обмен не идет. Особенно активно протекает изотопный обмен между группами ОН, NH и водой. Быстро идет обмен α-водородных атомов кетонов в основаниях и обмен орто- и пара-водородных атомов ароматических аминов в кислотах. В ароматических аминах водородный обмен зависит от силы этих щелочных соединений.
В общем случае можно сказать, что в изотопном обмене преимущественно участвуют те атомы протия, для которых характерно более сильное сверхтонкое расщепление спектральных линий. Иными словами, тяжелый изотоп замещает в химических соединениях преимущественно тот водород, который связан наиболее прочно.
Что же получается в результате такого изотопного обмена? Электронная поляризуемость молекул и показатель преломления при замене протия на дейтерий снижаются. Поскольку частота электронного перехода у дейтерия выше, чем у протия, то и энергия такого перехода в первом случае больше, чем во втором. Впрочем, это относится лишь к низким температурам. При средних температурах эта разность менее заметна, а при повышенных - энергия электронного перехода у дейтерия становится меньше, чем у протия.
При обычной температуре энергия водородной связи в тяжелой воде на 340кал/моль больше, чем в протиевой (разность энергии ассоциации). Замещение легкого изотопа водорода тяжелым увеличивает на несколько процентов осмотический коэффициент. Энтальпия смешения (-∆Hсмеш) протиевых систем больше, чем дейтериевых, тогда как изобарный потенциал смешения (∆Zсмеш), наоборот, выше для дейтериевых. Кривые взаимной растворимости химических соединений показывают, что для достижения той же растворимости в тяжелой воде требуется поддерживать более высокую температуру, чем в воде обычной. Вязкость дейтериевых соединений, как правило, выше на 10-15 %. Лишь при замещении протия дейтерием в хлороформе и тетрабромэтане вязкость уменьшается на 1-1,5 %. Это - первый случай, когда замена Н на D понижает вязкость. Объясняется он наложением двух факторов, влияющих на вязкость в противоположных направлениях повышением молекулярного веса и ослаблением вандерваальсова взаимодействия. Критическая температура кипения указанных соединений после дейтерообмена снижается.
Различие в скорости реакций неожиданно оказывается значительно больше того, какое можно было бы ожидать, исходя из разницы в скорости теплового движения молекул, содержащих дейтерий или протий. Анализ механизма реакций показал наличие существенного эффекта. При замещении Н на D при комнатной температуре наблюдается 6-8-кратное замедление реакций. При более высоких температурах этот эффект сглаживается. Поланьи утверждает, что дейтерий, как правило, реагирует медленнее протия. Так, при 0 °С протий взаимодействует с хлором в 13,4 раза быстрее, чем дейтерий. По сравнению с протиевыми соединениями химическая реакционная способность дейтериевых соединений тоже обычно ниже. K. Поланьи считает, что, хотя потенциальная яма у атома дейтерия глубже, чем у атома протия, и энергия активации первого атома соответственно выше, бывают случаи, когда в новом положении (в новой молекуле) дейтерий приобретает дополнительную энергию, и тогда он реагирует быстрее протия [23].
Особенно заметная разница в скорости взаимодействия наблюдается в случае химических реакций, идущих с участием катализаторов. Известно, что скорость реакции синтеза аммиака в присутствии электролитического водорода на 10 - 40 % выше скорости реакции с использованием водорода, полученного железопаровым способом. Это объясняется не наличием тех или иных примесей, так как в обоих случаях водород тщательно очищается, а в том, что в железопаровом водороде по самому способу его получения содержится весь дейтерий, внесенный с водяным паром, а в электролитическом, наоборот, дейтерия совсем немного [24]. Последнее объясняется тем, что водородные ионы, представленные дейтерием, движутся в электролитах гораздо медленнее, чем ионы протия. Поэтому при получении электролитического водорода дейтерий концентрируется в электролитических ваннах. На этом основан один из промышленных способов получения тяжелой воды.