В отличие от некроза апоптоз - не обязательно проявление патологического процесса. Этот важный внутриклеточный процесс часто инициируется во время нормального жизненного цикла клетки с целью поддержания гомеостаза в организме. Апоптоз является важным механизмом изменения численности клеток в развитии организма. Существует множество физиологических процессов (наблюдающихся в основном в ходе морфогенеза или поддержания нормального состава обновляющихся клеточных популяций), когда клетки, завершившие свой жизненный цикл, удаляются путем апоптоза. Этот процесс характерен для формирования в эмбриональном онтогенезе суставных щелей, разделения пальцев верхних и нижних конечностей и др. У детей в возрасте 8-14 лет путем апоптоза погибает до 20-30 миллиардов клеток каждый день, а в организме взрослого человека - среднем от 50 миллиардов до 70 миллиардов клеток.
Апоптоз контролируется различными клеточными сигналами, которые носят экстраклеточный или интраклеточный характер [5, 6] и приводят к повреждению ДНК [6]. В процесс апоптоза клетки вовлекаются с увеличением возраста, под действием ультрафиолета, химических или физических факторов, токсинов, гормонов, факторов роста, оксида азота и др., а также при таких заболеваниях, как СПИД, болезнь Альцгеймера и Паркинсона, инфаркт миокарда, остеопороз, остеоартроз и др.
Апоптоз может иметь место, если в клетке произошла мутация, которая может привести к неконтролируемому опухолевому росту, при этом низкий уровень апоптоза способствует прогрессированию опухолевого процесса. Однако точка зрения на этот факт неоднозначна. В последние годы получены данные, что у низкодифференцированных опухолей имеет место высокая апоптозная активность, а у высокодифференцированных она значительно ниже [7].
Путем апоптоза клетки погибают при воспалительном процессе, в частности, гибель лимфоцитов отмечается на заключительных этапах инфекционного процесса, когда организм уже не нуждается в дальнейшей выработке антител. Однако высокий уровень апоптоза может приводить к выраженному снижению численности клеток, например при нейродистрофических процессах.
Таким образом, клеточные сигналы, контролирующие апоптоз, могут носить позитивный или негативный характер.
К гибели клетки путем апоптоза приводит класс протеаз, называемых каспазами, которые присутствуют в клетке в неактивной форме (в качестве проэнзимов). Каспазы - семейство эволюционно консервативных цистеиновых протеаз, которые специфически активируются в апоптозных клетках и играют ключевую роль в механизмах программируемой смерти клетки. В своих субстратах они катализируют гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами аспарагиновой кислоты [8].
В целом процесс апоптоза можно представить в виде трех этапов [9]:
активация каспаз специфическим сигналом;
активация эффекторных каспаз инициирующими каспазами, первые выполняют функцию расщепления в специфических местах;
деградация важных клеточных белков каспазами.
Финальная стадия апоптоза характеризуется разрушением ДНК и формированием апоптозных телец различной формы и размера.
Молекулярные процессы апоптоза запускаются в цитозоле, на мембранах, но реализуются только в ядре за счет репрессии генов и необратимого процесса межнуклеосомной фрагментации ДНК. В зависимости от стимулов, инициирующих апоптоз, можно выделить два главных внутриклеточных апоптозных сигнальных каскада: путь через рецепторы смерти и митохондриальный путь.
Механизмы активации инициирующих каспаз могут быть различными. Рецепторный путь запуска каспазного каскада начинается с активации расположенных на клеточной мембране рецепторов, воспринимающих внешний сигнал.
В последние годы получены данные, касающиеся роли митохондрий в апоптозе. При митохондриальном пути запуска каспазного каскада ключевым звеном является изменение состояния митохондрий.
Выделены три фазы, включающие:
премитохондриальную, на которой происходит активация путей повреждения;
митохондриальную, свзанную со снижением функции митохондрий;
постмитохондриальную, проявляющуюся выделением из митохондрий активных проапоптозных компонентов, приводящих к гибели клетки [9].
При нарушении целостности мембраны из митохондрий выходит ряд белков. В митохондриях существует и некаспазный путь, приводящий к апоптозу. На наружной мембране митохондрий локализована большая часть белков семейства Bcl-2, в состав которого входят промоторы (Bax, Bid и Bik) и ингибиторы (собственно Bcl-2 и Bcl-XL) апоптоза. От соотношения активности этих белков зависит, состоится апоптоз или нет. Особую роль играет белок Bcl-2 как фактор антиапоптического действия. В норме он закрывает митохондриальные поры, препятствуя высвобождению цитохрома С.
Один из белков семейства Bcl-2, промотор апоптоза Bid, может связывать рецепторный и митохондриальный пути.
Митохондрии являются ключевым звеном в передаче сигнала во время апоптоза, связанного с повреждением ДНК при действии на клетку разного рода факторов. Важную роль при этом играет также белок p53, который, перемещаясь в митохондрию, стимулирует открытие пор.
Описаны дополнительные пути апоптоза, которые могут происходить в комплексе Гольджи. В нем экспрессируется каспаза 2, основной мишенью которой является расщепление белка гольджин-160, индуцирующего апоптоз.
Многие молекулярные механизмы апоптоза на сегодняшний день расшифрованы. Выделены ключевые белки, обеспечивающие процессы апоптоза, однако механизмы их активации требуют дальнейших исследований. Остается открытым вопрос о том, сможет ли клетка выйти из апоптоза, включенного физиологическим апоптическим сигналом, особенно в случае, если каспазы уже были активированы [10].
Методы исследования апоптоза подробно описаны
[11]. Метод световой микроскопии позволяет выявить клетки с пикнотичными
ядрами, а также вариант апоптического нарушения структуры ядра - кариорексис.
Используют гистохимические методы, позволяющие выявить белки - маркеры
апоптоза. Больше информации можно получить при использовании флюоресцентной
микроскопии, основанной на применении для окраски флюоресцентных красителей.
Клетки с апоптозом возможно верифицировать методом проточной цитофотометрии.
Олигонуклеосомную деградацию ДНК изучают методом in situ. Фазы формирования
нарушений в ядре и формирование апоптических телец возможно выявить методом электронной
микроскопии.
1.3 Молекула ДНК
Р. Альтман впервые получил нуклеиновую кислоту, свободную от белков в 1889 г. и ввел этот термин в биохимию [12]. В результате дальнейшего изучения химического состава нуклеиновых кислот удалось установить, что в природе их существует два типа, причем долгое время существовала уверенность в том, что ядра клеток животных содержат только ДНК, а ядра клеток растений - только РНК. И лишь к середине 1930-х годов было доказано, что ДНК и РНК содержатся в каждой живой клетке. Первостепенная роль в утверждении этого фундаментального положения принадлежит А. Н. Белозерскому, впервые выделившему ДНК из растений. С развитием методов цитохимии и гистохимии к концу 1940-х годов было установлено, что ДНК локализуется преимущественно в ядре, а РНК - в цитоплазме клеток [13].
К началу 1950-х годов работы по изучению химического строения нуклеиновых кислот были завершены. Было выяснено строение их мономеров - нуклеозидов и нуклеотидов, и доказано, что и в ДНК, и в РНК нуклеотидные остатки связаны между собой в полимер только фосфодиэфирной связью. Выдающейся вехой в изучении нуклеиновых кислот стало открытие О. Эйвери с сотрудниками, которые показали, что с помощью чистой ДНК наследуемый признак может быть перенесен из одной клетки в другую. Так было доказано, что ДНК является носителем генетической информации. В 1953 г. Дж. Уотсон и Ф. Крик сумели правильно интерпретировать данные рентгенеструктурного анализа ДНК, накопленные в лабораториях Р. Франклин и М. Уилкинса, и на их основе построить модель пространственной структуры ДНК. Они показали, что макромолекула ДНК - это регулярная двойная спираль, в которой две полинуклеотидные цепи строго комплементарны друг другу. Из анализа модели следовало, что после расплетания двойной спирали на каждой из полинуклеотидных нитей может быть построена комплементарная ей новая, в результате чего образуются две дочерние молекулы, неотличимые от материнской ДНК. Через пять лет М. Мезельсон и Ф. Сталь экспериментально подтвердили этот механизм, а несколько раньше в 1956 году А. Корнберг открыл фермент ДНК-полимеразу, который на расплетенных нитях, как на матрицах, синтезирует новые, комплементарные им цепи ДНК [14].
Открытие генетической роли ДНК потребовало решения другой фундаментальной задачи - поддержания стабильности молекулы ДНК и ее постоянства при передаче в ряду поколений.
Созданию современных представлений о метаболизме
ДНК и гармоничном взаимодействии процессов репликации, рекомбинации и репарации
во время клеточного цикла препятствовала утвердившаяся к середине 50-х годов
прошлого века парарадигма о безупречности и совершенстве - а, следовательно, и
неизменности - двунитевой молекулы ДНК. Вторая половина XX века прошла под
знаком изменения этой парадигмы и осознания динамического равновесия между
постоянно возникающими повреждениями ДНК и восстановлением этих повреждений.
1.3.1 Химическая структура ДНК
Молекулы ДНК являются линейными макромолекулами, представляющими собой длинные двойные цепи полимеров, составленных из мономеров, получивших название нуклеотидов (малых органических молекул) и являющихся строительными блоками ДНК. У всех живых существ макромолекулы ДНК построены по одному и тому же плану. Они слагаются в основном из одних и тех же нуклеотидов, каждый из которых содержит по одной молекуле фосфорной кислоты и сахара, а также одно из четырех азотистых оснований - аденин, гуанин, цитозин или тимин. Аденин и гуанин являются пуриновыми основаниями, тогда как тимин и цитзин - пиримидиновыми. Пурины и пиримидины называют основаниями по той причине, что в кислой среде они способны присоединять к себе ион водорода. Пиримидины являются производными шестичленного пиримидинового кольца, тогда как пурины представляют основания, у которых второе пятичленное кольцо слито с шестичленным кольцом.
Сахаром в ДНК является дезоксирибоза, отличающаяся от глюкозы тем, что в ее молекуле не 6, а 5 атомов углерода, т. е. является пятиуглеродным сахаром (пентозой). Особенностью этого сахара является также то, что он имеет атом водорода, присоединенный к одному из атомов углерода, но не гидроксильную группу. Следовательно, этот сахар представляет собой дезоксирибозу, т. к. он является рибозой, лишенной кислорода.
Сахарофосфат соединяется с азотистым основанием, такая структура носит название нуклеозида. Таким образом, химическими группами, которые образуют ДНК, являются пуриновые и пиримидиновые азотистые основания (аденин, гуанин, тимин и цитозин), сахар (дезоксирибоза) и фосфорная кислота.
РНК характеризуется такой же структурой, как и ДНК. Однако в отличие от ДНК в РНК сахаром является рибоза с кислородом, представляющая собой сахар с 5 атомами углерода, к одному из которых прикреплена гидроксильная группа. Кроме того, в РНК тимин не имеет метильной группы и является урацилом, т. е. в РНК тимин заменен на урацил, также являющийся пиримидиновым основанием [14].
Нуклеиновые кислоты называют кислотами по той причине, что их фосфатные группы освобождают в растворах ионы водорода.
Для ДНК характерна структура трех видов - первичная, вторичная и третичная. Первичная структура ДНК заключается в том, что ДНК состоит из нуклеотидных цепей, у которых скелетную основу составляют чередующиеся сахарные и фосфатные группы, объединенные ковалентными фосфодиэфирными, скелетными связями, а боковые группы представлены тем или иным основанием и присоединяются одна к другой молекулой сахара. Последовательно располагающиеся нуклеотиды ковалентно связаны фосфодиэфирными связями между сахарным остатком и фосфатом, и в результате этого объединены в полинуклеотидную цепь. Таким образом, первичная структура ДНК (как и РНК) определяется последовательностью нуклеотидов и характером их связей между сахарным остатком и фосфатом.
Представления о вторичной структуре ДНК были сформулированы Д. Уотсоном и Ф. Криком еще в 1953 г [14].
Молекула ДНК построена из двух скрученных направо спиралевидных полинуклеотидных цепей, причем каждый виток спирали соответствует 10 азотистым основаниям или расстоянию в 3,4 нм [15]. Молекулы ДНК, цепи которых скручены направо, первоначально назвали В-формой.
Обе цепи объединены в результате закручивания одной цепи вокруг другой по общей оси. Из-за противоположной последовательности атомов в каждой цепи обе цепи инвертированы относительно одна другой.
Сахарофосфатные группы располагаются на внешней стороне двойной спирали, тогда как основания находятся внутри спирали под прямым углом и вдоль ее оси. Диаметр молекулы составляет 2 нм, расстояния между отдельными азотистыми основаниями в молекуле равны 0,34 нм. Таким образом, ДНК представляет собой скрученную в правостороннем направлении двойную спираль, в которой пары азотистых оснований А - Т и Г - Ц в комплементарных полинуклеотидных цепях подобны перекладинам в лестнице, а сахарофосфатные цепи являются каркасом этой лестницы.
Цепи в молекуле не идентичны, но комплементарны и
удерживаются слабыми водородными связями между азотистыми основаниями, причем
спаривание азотистых оснований для связывания цепей имеет специфический
характер. Водородные связи устанавливаются не просто между азотистыми
основаниями цепей, а специфически между пуриновым азотистым основанием одной
цепи и пиримидиновым азотистым основанием другой. В результате этого аденин
одной из цепей связывается с тимином другой цепи двумя водородными связями,
тогда как гуанин одной из цепей связывается с цитозином, находящимся в другой
цепи, посредством трех водородных связей.
1.3.2 Характер и типы повреждений ДНК
Повреждения молекул ДНК классифицируются следующим образом:
разрывы углеводно-фосфатного остова молекул;
вставки отдельных нуклеотидов;
выпадения отдельных нуклеотидов;
химические изменения отдельных нуклеотидов;
замен отдельных нуклеотидов;
образование сшивок азотистых оснований в пределах одной нити ДНК;
образование сшивок азотистых оснований между разными нитями ДНК;
образование сшивок между ДНК и белками.
Разрывы углеводно-фосфатного остова молекул ДНК приводят к различным перестройкам хромосом [16].
Вставки или выпадения отдельных нуклеотидов выражаются в том, что транскрибируемая с такого участка мРНК оказывается измененной. Однако если изменение произошло в промоторно-операторной области, то транскрипция будет изменена: она может не происходить вовсе, быть замедленной или ускоренной, может утратить способность к регуляции и т. д. Такие изменения могут привести к появлению терминирующего кодона в необычном месте, что отразится на размере и, конечно, качестве синтезированной мРНК. Если изменение не затронуло область, способную влиять на транскрипцию, и транскрипция прошла нормально, то результат изменения может проявиться в качестве продукта трансляции. Все будет зависеть от того, в какой по значимости области произошло изменение.
Однако может случиться так, что одновременно с выпадением одного из нуклеотидов в близлежащей области произойдет вставка другого нуклеотида. В этом случае второе изменение как бы исправляет результат первого. Одна мутация исправляет другую. Такие мутации получили название супрессорных [17]. Ввиду того, что генетический код триплетен, очевидно, что выпадение или вставка трех нуклеотидов подряд, если такие изменения не затрагивают существенно важную для функции область, не окажут большого влияния на протекание транскрипции, трансляции и последующее функционирование белкового продукта.
Химические изменения или замены отдельных нуклеотидов в молекулах ДНК проявляются в виде генных мутаций либо сразу же, либо после акта очередной репликации ДНК, вследствие включения во вновь синтезированную цепь ДНК нуклеотида с измененным азотистым основанием. При этом возможны два типа замен: пурин заменяется на пурин, а пиримидин - на пиримидин или же пурин заменяется на пиримидин, а пиримидин на пурин. Первый тип замен называют транзициями, второй - трансверсиями. Как правило, замены типа транзиций или трансверсий приводят к появлению двух типов мутаций: нонсенс (бессмысленных) или миссенс (с искаженным смыслом) мутаций. При миссенс-мутации в процессе трансляции в определенную позицию помпептидной цепи включается другая аминокислота. При нонсенс-мутации кодон заменяется таким, который не определяет включение ни одной из аминокислот. Следовательно, значащий кодон превращается в незначащий, терминирующий. Естественно, важность такого рода мутаций тем больше, чем в более существенной области она произошла. Как правило, нонсенс-мутации очень сильно отражаются на структуре и функциональной активности соответствующих белков, вплоть, до полной утраты ими активности и летального для клетки исхода [17]. Если же считываемый оперон состоит из нескольких структурных генов, а нонсенсмутация произошла в первом из них, то она существенно понижает синтетическую активность всех последующих генов оперона. Такие мутации называют полярными. Например, у гистидинового оперона сальмонеллы, состоящего из семи структурных генов, нонсенс-мутации в четырех из них не только инактивировали сами гены, но и в 2-10 раз снижали синтетическую активность генов, транскрибировавшихся после мутировавших.