Дипломная работа: Определение бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах с предварительным микроэкстракционным концентрированием

4. Схема ВЭЖХ-УФ определения бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах с предварительным микроэкстракционным концентрированием

4.1 Схема дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции бензойной и сорбиновой кислот с застыванием фазы экстрагента

При изучении мешающего влияния компонентов матрицы сока (п. 3.4.) было установлено, что сорбиновая кислота также способна экстрагироваться в ментол, в этом случае при оптимизированных ВЭЖХ-УФ условиях, она представлена отдельным пиком на хроматоргамме (п. 3.2.). Сорбиновая кислота и её соли, как было отмечено в п.1.1., являются консервантами, оказывающими негативное влияние на здоровье человека [75]. В связи с этим, была рассмотрена идея разработать метод выделения и концентрирования не только бензойной, но и сорбиновой кислот, а также их солей, из сложных по составу матриц жидкофазных пищевых продуктов.

Дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция бензойной и сорбиновой кислот с застыванием фазы экстрагента является модифицированной версией жидкостно-жидкостной микроэкстракции, описанной в п. 3.1. Она состоит из следующих этапов: 1) введения раствора образца в экстракционную виалу, приготовленную согласно п. 2.5; 2) термостатирования системы при температуре выше температуры плавления экстрагента (ментола); 3) образования отдельной фазы (ментола) на поверхности раствора с выделенными в неё аналитами; 4) застывания фазы экстрагента за счет понижения температуры; 5) удаления водной фазы с помощью шприца; 6) добавления к фазе экстрагента метанола (1:1) и последующего нагревания системы до образования гомогенного раствора с целью исключения засорения ВЭЖХ системы; 7) анализа полученного раствора методом ВЭЖХ-УФ. На рисунке 7 представлена схема описанного метода. Было установлено, что застывание фазы экстрагента позволяет увеличить эффективность экстракции по сравнению с вариантом, не включающим этот этап (п. 3.1). Из рисунка 8 видно, что аналитический сигнал более чем в 2 раза отличается от сигнала, полученного с помощью ранее разработанной схемы анализа, что положительным образом сказывается на аналитических возможностях нового метода. Это может быть объяснено частичным растворением ментола в водной фазе пробы при высоких температурах, приводящий к менее эффективному извлечению аналитов в фазу экстрагента на поверхности пробы, что устраняется в варианте застывания фазы экстрагента, вследствие которого весь ментол, находящийся в системе застывает на поверхности пробы. Кроме того, объяснением может служить тот факт, что с понижением температуры, уменьшается растворимость аналитов в водной фазе.

Рисунок.7. Схема определения бензойной и сорбиновой кислот в жидкофазных пищевых продуктах

Рисунок 8. Хроматограммы, полученные при определении бензойной и сорбиновой кислот по ранее разработанной и модифицированной схемам анализа

( = 25мг/л, = 25мг/л;.

4.2 Оптимизация условий микроэкстракционного извлечения бензойной и сорбиновой кислот

Первый этап оптимизации условий извлечения кислот проводился в соответствии с дробным двухуровневым многофакторным дизайном эксперимента, он включал в себя выбор параметров экстракции сорбиновой кислоты, так как для бензойной кислоты они были оптимизированы в п. 3.3. После серии аналогичных экспериментов, было установлено, что условия микроэкстракционного извлечения сорбиновой и бензойной кислот совпадают.

Таким образом, второй этап оптимизации заключался в выборе условий застывания фазы экстрагента. К факторам, влияющим на этот процесс, можно отнести: температуру и время застывания экстрагента, а также влияние атмосферного воздуха.

Хроматографическое разделение кислот проводилось в соответствие с пунктом 3.2.

4.2.1 Изучение влияния температуры застывания экстрагента

Для выбора оптимальной температуры застывания ментола были рассмотрены три значения температуры, первое из которых соответствует комнатной температуре (23 °С), второе - температуре в холодильной камере (6 °С), а третье - в морозильной камере холодильника (-24 °С). Выбор температур был обусловлен простотой выполнения эксперимента, во избежание использования специальных устройств (например, криостата). Время застывания - 10 минут.

Было установлено, что температура застывания не влияет на эффективность извлечения (площади пиков кислот практически совпадают с учётом СКО). Поэтому в качестве оптимальной была выбрана температура 6 °С, соответствующая температуре холодильной камеры (рис. 9). Комнатная температура не была рассмотрена для дальнейших экспериментов, поскольку при меньшем времени охлаждения системы застывания фазы экстрагента не происходило.

Рисунок 9. Влияние температуры застывания экстрагента на извлечение бензойной и сорбиновой кислот

= 25 мг/л, = 25 мг/л; t=10 мин).

4.2.2 Изучение влияния времени застывания экстрагента

Время застывания экстрагента является вторым важным параметром, который влияет на эффективность извлечения и концентрирования кислот, а также на производительность метода в целом. Рассматривалось четыре временных значения: 5, 10, 15 и 20 мин. Минимальное время (5 мин) обусловлено временем, необходимым для полного застывания фазы экстрагента, максимальное (20 мин) - ограничивалось производительностью метода. Из рисунка 10 можно видеть, что при увеличении времени застывания фазы экстрагента аналитический сигнал практически не изменяется. В связи с этим, для последующих исследований было решено в качестве оптимального параметра принять время застывания ментола 5 минут.

Рисунок 10. Влияние времени застывания экстрагента на извлечение бензойной и сорбиновой кислот

= 25мг/л, = 25мг/л; T= 6°С;).

4.2.3 Изучение влияния атмосферного воздуха на экстракцию кислот

Кроме того, было изучено влияние контакта экстракционной системы с атмосферным воздухом. С одной стороны, открытый сосуд мог привести к потере аналитов и загрязнению пробы, а с другой, ускорить процесс фазового перехода ментола из жидкого в твёрдое состояние. Как видно из представленной зависимости, площади пиков кислот выше в случае эппендорфа с открытой крышкой. При этом разброс значений практически не отличается. Кроме того, в случае открытой системы застывание ментола происходит значительно быстрее, что положительно сказывается на производительности метода.

Рисунок 11. Влияние контакта экстракционной системы с атмосферным воздухом на экстракцию бензойной и сорбиновой кислот

= 25мг/л, = 25мг/л; T= 6°С; t=5 мин).

Таким образом, в качестве оптимальных условий застывания фазы экстрагента были выбраны следующие: 6 °С, 5 минут, открытая крышка эппендорфа.

4.3 Аналитические характеристики разработанной схемы

В выбранных оптимальных условиях были изучены и установлены такие параметры, как диапазон определяемых концентраций, предел обнаружения, коэффициент корреляции и повторяемость.

Градуировочные зависимости, построенные по шести точкам, линейны в области концентраций от 0,1 до 150 мг/л для бензойной кислоты и от 0,05 до 100мг/л для сорбиновой кислоты и выражаются уравнениями: и (рис. 12). Предел обнаружения, рассчитанный как 3у, составил 0,03 мг/л для бензойной и 0,02 мг/л для сорбиновой кислоты.

Рисунок. 12. Градуировочные зависимости для определения содержания бензойной и сорбиновой кислот

Повторяемость характеризовалась при помощи среднеквадратичного отклонения (СКО), которое рассчитывалось по полученным данным в течение 5 дней. Таким образом, СКО составило 4 % и 2 % для бензойной и сорбиновой кислот соответственно, рассчитанных для с концентраций 25 мг/л. Аналитические характеристики разработанной схемы приведены в таблице 12.

Таблица 12. Аналитические характеристики разработанной схемы

Время процедуры пробоподготовки составляет 8 минут. Модифицированный метод также является простым, быстрым, лёгким, привлекательным с точки зрения «зеленой» аналитической химии, и не требует сложного оборудования, ментол обеспечивает селективное извлечение бензойной и сорбиновой кислот. Использование одноразовых экстракционных виал предотвращает риск загрязнения проб («эффект памяти») и делает возможным пробоподготовку on-site.

4.4 Испытание разработанной схемы анализа на реальных образцах

Возможности разработанной схемы были продемонстрированы на определении бензойной и сорбиновой кислот в жидкофазных пищевых продуктах: двух детских соках, трёх газированных напитках и одном соевом соусе. На упаковках соков и соевого соуса было указано, что они не содержат данных консервантов, производители газированных напитков отметили содержание только консерванта E210 (бензойной кислоты) или E211 (бензоата натрия).

Концентрации целевых аналитов в реальных образцах, полученных стандартным методом добавок, приведены в таблице 13. Как и было указано на упаковках газированных напитков, каждый из них содержал бензойную кислоту, однако её содержание не превышало норм, установленных Техническим Регламентом Таможенного Союза в безалкогольных ароматизированных напитках (150 мг/л). Соки и соевый соус не содержали представленных консервантов. Хроматограмма газированного напитка №1, полученная после проведения экстракции по разработанному методу, представлена на рисунке 13.

Рисунок 13. Хроматограмма газированного напитка, содержащего бензойную кислоту

Правильность полученных результатов была подтверждена референтным методом. В качестве референтного метода был выбран методика, описанная в пункте 3.5 [55].

Результаты, полученные с помощью двух методов были сравнены с помощью t- и F-тестов. Полученные F-значения ? 19 указывают на незначительное различие в величинах стандартных отклонений, а полученные t-значения ? 2,78 указывают на то, что нет статистически значимого различия между результатами, полученными при помощи двух методов. Данные представлены в таблице 13.

Таблица 13. Сравнение результатов определения бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах, полученных при помощи разработанного и референтного методов (n=3, P=0,95; F_k = 19,00; t_k = 2,78).

Выводы

ь Разработана новая схема дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции, в основе которой лежит использование свойств экстрагента с низкой температурой плавления, и исключающая негативное влияние диспергатора;

ь Разработанная схема является простой, экспрессной, селективной, и экологически безопасной; предназначена для определения бензойной и сорбиновой кислот в жидкофазных пищевых продуктах, не требует дополнительного оборудования и легко сочетается с ВЭЖХ-УФ детектированием;

ь Оптимизированы параметры, влияющие на эффективность микроэкcтракции: объём образца и экстрагента, рН среды, температура экстракции, температура и время застывания фазы экстрагента;

ь Аналитические возможности разработанной схемы показаны на примере определения бензойной и сорбиновой кислот в различных образцах сока, газированных напитков и соевом соусе, полученные результаты подтверждены референтным методом.

Благодарность

Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н. Тимофеевой Ирине Игоревне и д.х.н. Булатову Андрею Васильевичу за неоценимую помощь и поддержку, оказанную при выполнении данной работы, а также глубокую признательность д.х.н. Кирсанову Дмитрию Олеговичу за сотрудничество и помощь в расчетах. Автор благодарит «Ресурсный образовательный центр по направлению химия» за предоставленные ресурсы и оборудование.