Дипломная работа: Определение бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах с предварительным микроэкстракционным концентрированием

Таблица 5. Кодированные значения факторов

Выбор граничных условий температуры связан с температурой плавления ментола, взятой с учётом погрешности нагревания прибора (нижняя граница), и ограничениями возможностей оборудования (верхняя граница). Диапазон значений рН был выбран в кислой области для предотвращения диссоциации бензойной кислоты. Эффект высаливания изучался на двух категориальных уровнях. Объём экстрагента рассматривался от минимального для возможности последующего его отбора из системы до максимально разумного (в целях сокращения расхода реагента). Объём образца исследовался в таком диапазоне, чтобы при этом обеспечить экспрессность анализа.

Далее была составлена матрица дизайна, представленная в таблице 6. Используя дробный факторный анализ, число экспериментов составило 16.

Таблица 6. Матрица дробного пятифакторного двухуровневого дизайна эксперимента.

После выполнения каждого эксперимента (n=3), были получены отклики (значения площадей хроматографических пиков), на основании которых были рассчитаны коэффициенты регрессии, связывающие значения отклика и факторы, влияющие на методику определения. Их значения представлены в таблице 7.

Таблица 7. Коэффициенты регрессии, полученные для кодированной матрицы при дробном факторном планировании.

На основании полученных коэффициентов можно сделать следующие выводы:

Ш самым важным параметром является температура и, поскольку соответствующий коэффициент имеет отрицательный знак, чем ниже температура - тем выше эффективность извлечения. Таким образом, для дальнейшего исследования температура термостатирования составила 45 °С;

Ш более низкий объем экстрагента обеспечивает лучшую эффективность выделения бензойной кислоты;

Ш чем ниже значение рН, тем лучше извлечение;

Ш следующий наиболее важный коэффициент после рН - коэффициент взаимодействия между объемами экстрагента и образца;

Ш также важны взаимодействия между рН и объемом рвствора образца, и между рН и солью;

Ш остальные коэффициенты, по меньшей мере, в два раза меньше и, таким образом, имеют ограниченное влияние на результат эксперимента;

Ш эффекта высаливания не наблюдалось, поэтому соль не использовалось в дальнейших экспериментах.

Принимая во внимание значения коэффициентов взаимодействия между pH, объёмом экстрагента и объёмом образца, было сделано другое планирование эксперимента, включающее эти параметры. На этот раз, это был полный факторный дизайн для трех параметров по двум уровням. Значения рН составляли 1 и 2 для более подробного изучения его влияния в кислой области, объем растворителя составлял 100 и 200 мкл, объем образца - 1 и 2 мл. Матрица дизайна представлена в таблице 8. Таким образом, еще восемь экспериментов было проведено при фиксированной температуре 45 °С и без высаливающего агента (n=3).

Таблица 8. Матрица полного трёхфактороного двухуровневого дизайна эксперимента

На основании полученных откликов (площадь хроматографических пиков бензойной кислоты) были рассчитаны соответствующие коэффициенты регрессии (Таблица 9).

Таблица 9. Коэффициенты регрессии, полученные для кодированной матрицы при полном факторном проектировании

Из полученных результатов можно сделать следующие выводы:

Ш объем раствора образца, равный 2 мл, обеспечивает лучшее извлечение аналита в фазу экстрагента;

Ш объем экстрагента 100 мкл приводит к более эффективному концентрированию бензойной кислоты;

Ш в указанном диапазоне рН не оказывает влияния на эффективность экстракции;

Ш взаимодействия между параметрами не существенны.

На основании результатов двух приведенных выше серий экспериментов были выбраны следующие оптимальные условия пробоподготовки: температура нагревания системы 45 °С, pH 2, объём экстрагента 100 мкл, объём раствора образца 2 мл.

3.4 Изучение мешающего влияния матрицы сока

Было изучено мешающее влияние сорбиновой, аскорбиновой, лимонной, янтарной, яблочной, винной, щавелевой кислот, солей (хлорид алюминия, хлорид натрия, сульфат натрия), глюкозы и сахарозы, рутина, как возможных компонентов матрицы сока. Допустимая концентрация каждого мешающего агента считается менее 5 % относительной погрешности сигнала.

Было обнаружено, что все изученные вещества не влияют на определение бензойной кислоты даже при их 1000-кратном избытке.

Кроме того, использование ментола в качестве экстрагента при анализе реальных образцов обеспечивает появление единственного на хроматограмме пика бензойной кислоты (рис. 5).

Рисунок 5. Хроматограмма, полученная при определении бензойной кислоты ( = 25 мг/л) в соках с помощью разработанного метода

3.5 Аналитические характеристики разработанной схемы

В выбранных оптимальных условиях эксперимента были изучены следующие параметры: диапазон определяемых концентраций, предел обнаружения, коэффициент корреляции и повторяемость. Градуировочный график, построенный по семи точкам, линеен в области концентраций от 0,5 до 100 мг/л и выражается уравнением: Площадь пика = 285,6*[Концентрация бензойной кислоты] - 73,4 (R²=0,996) (рис. 6). Предел обнаружения по 3у, составил 0,15 мг/л.

Рисунок 6. Градуировочная зависимость для определения содержания бензойной кислоты с применением предложенной схемы анализа

Повторяемость характеризовалась при помощи среднеквадратичного отклонения (СКО), которое рассчитывалось по полученным данным в течение 5 дней. Таким образом, СКО составило 3-6 % и 4-8 % для 1 и 25 мг/л соответственно. Аналитические характеристики разработанного метода приведены в таблице 10.

Таблица 10. Аналитические характеристики разработанной схемы

Время процедуры пробоподготовки составляет 3 минуты. Описанный метод извлечения является простым, легким, быстрым, недорогим и не требует сложного оборудования. Ментол обеспечивает селективное извлечение бензойной кислоты.

3.6 Испытание разработанной схемы анализа на реальных образцах

Разработанный метод был продемонстрирован на примере определения бензойной кислоты в детских соках. На упаковках приобретенных напитков было указано, что они не содержат консервантов. Концентрации целевого аналита в реальных образцах, полученных стандартным методом добавления, приведены в таблице 11. Был обнаружен только один образец (ягодный сок), содержащий бензойную кислоту. Это можно объяснить тем, что некоторые ягоды, например, морошка, содержат её в естественном виде.

Правильность полученных результатов была подтверждена референтным методом. В качестве референтного метода была выбрана классическая дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракия с ВЭЖХ-УФ детектированием [55]. Пробоподготовка осуществлялась следующим образом: к 5 мл раствора сока, полученного предварительным разбавлением пробы сока дистиллированной водой в пять раз, добавляли 1 г NaCl, а также раствор серной кислоты в таком количестве, чтобы рН сока было равно 3 (кислотность контролировали с помощью индикаторной бумаги). Затем, в данный раствор вводили смесь, состоящую из 500 мкл метанола (диспергатор) и 100 мкл октилового спирта (экстрагент). Виалу с раствором образца и смесью экстрагентов трясли в течение 2 минут на шейкере, а затем центрифугировали в течение 10 минут при скорости 4000 об/мин. После этого, 20 мкл поднявшейся фазы экстрагента отбирали с помощью микродозатора и анализировали на ВЭЖХ-УФ. Подвижная фаза состояла из ацетатного буфера (0,2 М; pH=4,4) и ацетонитрила (50:50). Разделение проводили со скоростью потока 1 мл/мин при длине волны 225 нм.

Результаты, полученные с помощью двух методов были сравнены с помощью t- и F-тестов. Полученные F-значения ? 19 указывают на незначительное различие в величинах стандартных отклонений, а полученные t-значения ? 2,78 указывают на то, что нет статистически значимого различия между результатами, полученными при помощи двух методов. Данные представлены в таблице 11.

Таблица 11. Сравнение результатов определения бензойной кислоты, полученных при помощи разработанного и референтного методов (n=3, P=0,95; F_k = 19,00; t_k = 2,78)