Дипломная работа: Определение бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах с предварительным микроэкстракционным концентрированием

Рисунок 1. Разделение фенилуксусной (A) и бензойной кислот (B) методом капиллярного электрофореза [31] (t - время миграции веществ, мин)

К достоинствам КЭ также можно отнести высокую селективность, низкую стоимость и экспрессность анализа [32], быстрое разделение компонентов, а также высокую эффективность (большое число теоретических тарелок) [33]. Несмотря на значительное количество преимуществ, данный метод обладает рядом существенных недостатков. Во-первых, КЭ в редких случаях применим для образцов, не способных растворяться в водных или водно-спиртовых растворах. Во-вторых, при спектрофотометрическом детектировании наблюдается низкая чувствительность, что связано с малыми объёмами пробы и незначительной длиной оптического пути [34].

Спектрофотометрические методы исследования основаны на измерении спектров поглощения веществ в ультрафиолетовой (УФ) (200 - 400 нм) и видимой (400 - 750 нм) областях света. Образец раствора поглощает электромагнитное излучение от подходящего источника, при этом количество поглощённого излучения зависит от концентрации исследуемого соединения в растворе [35].

Для определения бензойной и сорбиновой кислот используется спектрофотометрия в УФ-области. Это очень простой, быстрый и дешёвый метод анализа. Однако зачастую требуется проанализировать не индивидуальный компонент, а смесь веществ, из-за этого возможно наложение их полос поглощения, что обуславливает погрешности идентификации. Отсюда и возникает основное ограничение УФ-спектрофотометрии [36]. Решение этой проблемы было найдено с помощью метода многомерной калибровки [37]. Однако, он не может быть применён, если ставится задача определения очень низких концентраций аналитов, или если объект исследования обладает сложной матрицей [38]. Также, данный метод является достаточно трудоёмким.

Наиболее популярными методами определения консервантов являются хроматографические методы с различными типами детектирования. Это обуславливается тем, что они универсальны, многокомпонентны, информативны, способны обеспечивать высокую чувствительность, экспрессность, легки в автоматизации, также при их реализации необходимы малые объёмы пробы [39].

Хроматография - метод разделения веществ, основанный на многократном распределении компонентов между фазами при их относительном перемещении в условиях, когда одна из фаз находится в диспергированном состоянии [40]. Существует большое разнообразие хроматографических методов. На основании литературных данных, для идентификации консервантов используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) со спектрофотометрическим детектированием в УФ-области (ВЭЖХ-УФ) [41], жидкостную хроматографию с масс-сспектрометрическим детектированием (ЖХ-МС) [42], мицеллярную электрокинетическую капиллярную хроматографию [43], газовую хроматографию с пламенно-ионизационным детектированием (ГХ-ПИД) [44], газовую хроматографию с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) [45], суперкритическую флюидную хроматографию [46].

1.3 Пробоподготовка при определении бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах

На сегодняшний день существует множество различных методов пробоподготовки, позволяющих увеличить эффективность определения консервантов в пищевых продуктах. Из литературных данных известно, что для обнаружения бензойной и сорбиновой кислот применяются жидкофазная экстракция (ЖФЭ) [47], жидкостно-жидкостная микроэкстракция (ЖЖМЭ) [48], микродиализ [25], твёрдофазная микроэкстракция (ТФМЭ) [49]. Их основными недостатками являются трудоёмкость, длительность, большой расход реактивов.

В таблице 2 представлены варианты методов пробоподготовки различных пищевых продуктов при определении в них бензойной и сорбиновой кислот.

Таблица 2. Сравнительные характеристики методов определения бензойной и сорбиновой кислот

Очевидно, что наиболее распространёнными методами пробоподготовки являются экстракционные методы, особенно жидкостно-жидкостная экстракция. Однако, классическая ЖЖЭ трудно автоматизируется, требует больших объемов токсичных органических растворителей и весьма продолжительна по времени [56]. Кроме того, зачастую при анализе образуются устойчивые эмульсии, что мешает разделению фаз. Ещё одним недостатком жидкостной экстракции является слабое концентрирование аналита из водной фазы в органическую, что снижает предельные возможности метода [57]. Для устранения недостатков традиционной ЖЖЭ была разработана микроэкстракция, отличие которой заключается в том, что при её реализации отношение объёмов водной и органической фаз находятся на уровне [58].

Один из наиболее популярных вариантов жидкостной микроэкстракции - дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция (ДЖЖМЭ). В классическом варианте она предполагает введение в водную фазу пробы смеси экстрагента и диспергатора. Экстрагентом является органический растворитель нерастворимый в воде и обладающий низкой летучестью, обычно его плотность выше, чем у воды. Диспергатор, наоборот, должен быть растворим как в водной фазе, так и в фазе экстрагента. При быстром введении такого раствора через шприц благодаря диспергатору образуется стойкая эмульсия, в результате чего резко повышается площадь соприкосновения двух фаз по сравнению с классической жидкостно-жидкостной экстракцией. Для удаления эмульсии и выделения органической фазы чаще всего прибегают к центрифугированию [59]. На рисунке 2 представлена схема ДЖЖМЭ.

Рисунок 2. Схема дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции

К основным её преимуществам можно отнести малый расход токсичных дорогостоящих растворителей, высокие коэффициенты концентрирования, простоту исполнения, и экспрессность. Однако наряду с её достоинствами, имеется ряд недостатков. Во-первых, диспергирующий растворитель, оставаясь в системе отрицательно влияет на процесс выделения аналитов в фазу экстрагента за счёт увеличения их растворимости в водной фазе. Во-вторых, к недостаткам можно отнести необходимость использования стадии центрифугирования и ограниченный набор подходящих органических растворителей, которые используются в качестве диспергаторов [60].

Авторы статьи [55] разработали методику пробоподготовки, основанную на дисперсионной микроэкстракции, для выделения и концентрирования бензоатов и сорбатов из йогуртов. В качестве диспергатора использовали этиловый спирт, экстрагентом был выбран октиловый спирт. Их предварительно смешивали, а затем вводили в раствор пробы, который содержал соль, обеспечивающую эффект высаливания. После чего, перемешивали, центрифугировали и анализировали с помощью ВЭЖХ-УФ.

Интересным является способ пробоподготовки молока, основанный на проведении этерификации in situ: 3 мл молока смешивали с 3 мл метанола и 1 мл концентрированной серной кислоты для образования метилового эфира бензойной кислоты, полученный раствор подвергали ультразвуковому воздействию в течение 15 минут. Затем, одну минуту перемешивали с помощью магнитной мешалки с 3 мл 10 %-ого раствора карбоната калия для удаления того количества аналита, которое не вступило в реакцию. На заключительном этапе проводили экстракцию полученного эфира 5 мл гексана с последующим ГХ-ПИД анализом [44].

В исследовании [32] была разработана пробоподготовка для уксуса и соевого соуса с целью определения в них 5 органических кислот, в том числе бензойной и сорбиновой. Её суть заключалась в экстракции липидов из 2 мл раствора образца в 1 мл тетрахлоруглерода, которые оказывали мешающее влияние на определение аналитов. Полученный водный раствор разбавляли дистиллированной водой в соотношении 1:10, затем фильтровали через мембрану с размером пор 0,45 мкм и проводили определение кислот методом КЭ-УФ.

Как уже было отмечено ранее, твёрдофазная микроэкстракция также входит в число экстракционных методов при определении бензойной и сорбиновой кислот. Так, например, её возможности продемонстрированы в работе [52], где пробоподготовка молока предполагала предварительное смешение пробы с ацетонитрилом (1:1), после чего полученную смесь выдерживали в УЗ-ванне в течение 10 минут, а затем ещё 10 минут подвергали центрифугированию. Полученный супернатант отфильтровывали, пропускали через активированную колонку С18, и проводили элюирование бензойной кислоты с колонки с последующим её определением методом ИХ-КД. Однако твёрдофазная экстракция имеет один существенный недостаток - неполная десорбция соединений, что приводит к искажениям результатов [61].

1.4 Оптимизация условий. Дизайн эксперимента

Основной задачей при разработке методов пробоподготовки является оптимизация условий. Традиционные методы исследований требуют значительных трудозатрат, так как основаны на большой серии экспериментов, предполагающих поочерёдное варьирование отдельных независимых факторов, в то время, как остальные фиксируют. Выводы, полученные на основании подобного планирования, в большинстве случаев являются случайными, а следовательно, и условия далеки от оптимальных [62]. Таким образом, классический подход не всегда эффективен.

В настоящее время широко используют статистические методы дизайна эксперимента, которые позволяют за минимальное число экспериментов подобрать подходящие условия [63].

Планирование начинается с определения факторов, влияющих на ход эксперимента. Значения или уровни для этих факторов выбирают таким образом, чтобы они были отличны друг от друга, но не слишком сильно, чтобы это не привело к снижению эффективности поиска оптимальных условий. После, строят матрицу дизайна, в которой столбцы - это значения параметров, а строки - условия эксперимента [64, 65]. Общее количество экспериментов рассчитывается по формуле:

, (1)

где - число экспериментов; - число уровней факторов; - число факторов.

Столбцы матрицы заполняют так, чтобы они были ортогональны, к тому же значения факторов должны быть сбалансированы. Пример матрицы трёхфакторного двухуровневого дизайна эксперимента представлен в таблице 3 [66]. Как правило, для удобства значения факторов кодируют: например, минимальному значению условно присваивают «-1», максимальному - «+1», а промежуточному - «0» [67].

Таблица 3. Полный трёхфакторный двухуровневый дизайн с матрицей планирования