Дипломная работа: Определение бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах с предварительным микроэкстракционным концентрированием

Выполняют серию этих экспериментов. Затем, создаётся математическая модель, которая соотносит экспериментально измеренный отклик (оптическая плотность, площадь хроматографического пика, разность потенциалов и т.п.) и величину фактора (температура, рН, масса катализатора и т.п.). В итоге, получается уравнение взаимосвязи между независимыми переменными и откликом:

, (2)

где - значения факторов; - линейные коэффициенты; - коэффициенты двойного взаимодействия; - отклик.

Также, данную зависимость (2) можно представить и в матричном виде:

, (3)

где - матрица дизайна.

Коэффициенты находят из уравнения (2) следующим образом:

, если - квадратная матрица; (4)

, если - неквадратная матрица. (5)

На основании полученных коэффициентов определяют значимость фактора: чем выше численное значение коэффициента, тем сильнее параметр влияет на процесс, а близость значения коэффициента к нулю, говорит о его незначительном воздействии, если значение отрицательное - то фактор негативно сказывается на процессе. Также, зная коэффициенты в уравнении (2) или (3), можно прогнозировать результаты эксперимента для новых условий [66, 68].

Если количество факторов велико, то учёт всех коэффициентов приводит к тому, что количество экспериментов возрастает. И, зачастую, полученная информация избыточна и не актуальна для экспериментатора.

Обычно наибольшей значимостью обладают линейные коэффициенты, а коэффициенты взаимодействий, начиная с тройных и выше, часто не так важны. Поэтому стараются сократить число опытов так, чтобы матрица дизайна эксперимента оставалась оптимальной. Такое планирование называют дробным факторным экспериментальным дизайном. Дробный факторный план является наиболее распространённым в настоящее время, поскольку значительно сокращает время исследования, при этом оставаясь эффективным при планировании эксперимента [70].

Синтетические консерванты находят широкое применение в пищевой промышленности, вследствие чего необходим контроль их содержания, поскольку они способны оказывать токсическое воздействие на организм человека.

На сегодняшний день разработано большое количество экспериментальных методик определения консервантов в пищевых продуктах. Почётное место среди них занимает дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция, которая представлена в различных вариантах. ДЖЖМЭ обладает множеством достоинств, основным из которых является повышение эффективности концентрирования за счёт увеличенной площади соприкосновения фаз вследствие диспергирования экстрагента. Однако у неё есть и явный недостаток - наличие диспергатора, негативно влияющего на процесс выделения аналитов в фазу экстрагента. К тому же, необходимость центрифугирования увеличивает время анализа.

Среди инструментальных методов предпочтение по праву отдаётся хроматографическим методам анализа с различными типами детектирования, поскольку они способны обеспечить многокомпонентный, высокоинформативный, универсальный, быстрый, легко автоматизируемый анализ. Стоит также отметить, что государственные стандарты рекомендуют проводить определение консервантов и красителей в пищевых продуктах методом жидкостной экстракции с последующим ВЭЖХ-УФ детектированием [71, 72].

Оптимизация условий анализа с помощью статистического дизайна эксперимента, позволяющего за минимальное число экспериментов, подобрать оптимальные условия, является значительным преимуществом при разработке методики определения аналитов в объектах исследования.

Для определения бензойной и сорбиновой кислот было разработано большое количество методов идентифицирования их в пищевой и косметической продукции, однако, учитывая сложность матрицы пищевых продуктов, разработка простых высокоэффективных методов пробоподготовки всегда остаётся актуальной задачей. Кроме того, в настоящее время уделяется большое внимание «зеленой» аналитической химии, что вызывает стремление к созданию экологически-безопасных методов, исключающих работу с токсичными реагентами.

Глава 2. Методика экспериментальных исследований

2.1 Средства измерений и оборудование

1. ВЭЖХ анализ проводился с помощью жидкостного хроматографа LC - 20 Prominence (Shimadzu, Япония) с фотометрическим детектором при длине волны 230 нм. Хроматографическое разделение осуществлялось на колонке Phenomenex C18 (250 Ч 4,6 мм, размер частиц 5мкм) в изократическом режиме при температуре 43?C. Подвижная фаза представляла собой смесь метанола и 0,05 М ацетата аммония в соотношении 30:70. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,5 мл/мин.

2. Электронные весы «Ohaus Pioneer PA214C» (Китай), 2-ой класс точности, предел взвешивания 210 г, погрешность 0,1 мг.

3. Термостат LOIP LT-910, диапазон рабочих температур 10-150 ^оС.

2.2 Реактивы и материалы

При выполнении экспериментальной части работы были использованы следующие реактивы:

1. Бензойная кислота, х.ч., ГОСТ 10521-78 ;

2. Сорбиновая кислота, х.ч., ГОСТ 32779-2014;

3. Ментол х.ч.;

4. Метанол о.с.ч. (Sigma-Aldrich);

5. Ацетат аммония х.ч.; ГОСТ 3117-78;

6. Серная кислота, х.ч., ГОСТ 4204-77;

7. Сульфат натрия, х.ч. по ГОСТ 4166-76;

8. Хлорид натрия, х.ч., ГОСТ 4233-77;

9. Аскорбиновая кислота, ч.д.а.;

10. Лимонная кислота, х.ч., ГОСТ 908-2004;

11. Хлорид алюминия, х.ч., ГОСТ 3759-75;

12. Глюкоза, х.ч., ГОСТ 975-88;

13. Октан-1-ол, ч.д.а. («Эколан», Россия);

14. Яблочная кислота, х.ч., ГОСТ 32748-2014;

15. Янтарная кислота, х.ч., ГОСТ 6341-75;

16. Винная кислота, х.ч., ГОСТ 5817-77;

17. Щавелевая кислота, х.ч., ГОСТ 22180-76;

18. Рутин, х.ч. (Alfa Aesar);

19. Изопропиловый спирт, о.с.ч. (Sigma-Aldrich);

20. Ацетонитрил, о.с.ч. (Sigma-Aldrich).

2.3 Приготовление растворов

Приготовление 100 мг/л растворов бензойной и сорбиновой кислот

В химический стакан помещали 0,01 г каждой из кислот и растворяли в 300 мкл метанола. После полного растворения навески кислоты, раствор количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, стакан промывали тремя порциями деионизованной воды по 5 мл, доводили объём раствора в колбе до метки деионизованной водой и тщательно перемешивали. Исходные растворы хранили в холодильнике. Рабочие растворы готовили ежедневно путём последовательного разбавления исходных растворов дистиллированной водой.

Приготовление 25 мг/л раствора смеси бензойной и сорбиновой кислот с рН=2

В мерную колбу объёмом 50 мл помещали по 12,5 мл каждого из растворов кислот с концентрацией 100 мг/л и 5 мл раствора серной кислоты с концентрацией М (рН=1), доводили объем раствора до метки деионизованной водой и тщательно перемешивали.

2.4 Пробоотбор и подготовка

Детские соки, газированные напитки и соевый соус были приобретены в местных супермаркетах. Все соки, газированные напитки были различных марок и вкуса. Предварительной пробоподготовки перед анализом не проводилось, несмотря на то, что некоторые соки содержали мякоть, а газированные напитки - красители.

Реальные образцы с добавкой бензойной кислоты (100 мг/л) готовили следующим образом: в химический стакан помещали 0,001 г кислоты и растворяли в 300 мкл метанола. После полного растворения навески кислоты, раствор количественно переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл, стакан промывали тремя порциями соответствующего продукта по 1,5 мл, доводили объём раствора в колбе до метки соком и тщательно перемешивали. При необходимости получения более низкой добавки аналита - образцы разбавляли соответствующим продуктом питания.

Образцы с введенной добавкой смеси бензойной и сорбиновой кислот готовили аналогичным образом.

2.5 Приготовление экстракционных виал

Для приготовления экстракционных виал ментол в термостойком стакане нагревали в термостате при температуре 45 ?C до перехода его в жидкое агрегатное состояние. Дозатором отбирали ментол объёмом 100-300 мкл, аккуратно помещали на дно эппендорфа. Оставляли открытым сосуд с жидким ментолом при комнатной температуре на 20 минут до полного застывания экстрагента. Приготовленные виалы хранили при комнатной температуре в закрытом эппендорфе. Срок годности - не ограничен.

Глава 3. ВЭЖХ-УФ определение бензойной кислоты в соках с предварительным микроэкстракционным концентрированием

3.1 Схема дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции бензойной кислоты

В данной работе был разработан новый вариант дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции. Основным преимуществом, которого является отсутствие диспергирующего растворителя, который, как было показано в главе 1, уменьшает коэффициенты распределения гидрофобных аналитов в экстрагенте. Реализовать данный подход удалось благодаря такому свойству экстрагента, как относительно низкая температура плавления. Первое упоминание об использовании растворителей с таким свойством найдено в работе М. Сатака и др. [53]. Авторы разработали метод жидкостно-жидкостной экстракции металлов в нафталин с последующим выделением твердой фазы экстрагента. Для этого металл экстрагировали в виде комплекса расплавленным нафталином при высокой температуре и перемешивании; после застывания фазы экстрагента путем понижения температуры, её отделяли от водной фазы фильтрованием, растворяли в диметилформамиде, смешивали с электролитом и проводили определение методом полярографии.

В рамках данного исследования в качестве экстрагента с низкой температурой плавления использовали ментол, свойства которого представлены в таблице 4. Он представляет собой прозрачное вещество, которое можно получить, выделив из эфирного масла мяты, что делает его привлекательным с точки зрения «зелёной» химии [73].

Таблица 4. Структурная формула и физические свойства ментола

Рисунок 3. Схема определения бензойной кислоты в соках

На рисунке 3 представлена схема разработанного метода. Согласно данной схеме, жидкую пробу помещали в экстракционную виалу, приготовленную по п. 2.5. Затем виалу выдерживали в термостате при температуре выше температуры плавления ментола. По мере нагревания системы, экстрагент, плотность которого меньше плотности воды, поднимался вверх. В результате на поверхности раствора пробы появлялась отдельная фаза экстрагента, с выделенным в неё аналитом. Органическую фазу отбирали, добавляли к ней метанол (1:1) во избежание последующего застывания ментола, и анализировали методом ВЭЖХ-УФ.

3.2 Выбор условий ВЭЖХ-УФ определения бензойной кислоты

Важным этапом работы оказался выбор условий ВЭЖХ-УФ анализа.

На первоначальном этапе условия определения бензойной кислоты были выбраны на основании литературных данных [25]: детектирование проводилось при длине волны 230 нм в изократическом режиме на колонке на основе силикагеля. Подвижная фаза представляла собой смесь ацетонитрила и фосфорной кислоты (5 мМ) в отношении 40:60 соответственно. Скорость потока фазы составляла 1 мл/мин. Температура колонки поддерживалась при постоянном значении, которое составляло 43 °С, во избежание застывания ментола в колонке.

Однако, на этапе изучения мешающего влияния компонентов матрицы пробы, было установлено, что сорбиновая кислота также способна экстрагироваться в ментол, при этом реализуемые условия ВЭЖХ-УФ анализа не обеспечивают разделение пиков двух кислот.

Поэтому, условия ВЭЖХ-УФ определения бензойной кислоты (а в последствии и сорбиновой кислоты) были взяты из литературных данных [47]: в качестве подвижной фазы использовалась смесь метанол:ацетат аммония (0,05 М) в соотношении 30:70, стационарная фаза представляла собой колонку с привитыми октадецильными группами. Режим разделения - изократический, длина волны - 230 нм, скорость потока фазы - 0,5 мл/мин. Времена удерживания бензойной и сорбиновой кислот составляли =8,4 мин и =10,4 мин соответственно (рис. 4).

Рисунок 4. Хроматограмма определения бензойной и сорбиновой кислот = 25 мг/л, = 25 мг/л) в соках.

3.3 Выбор оптимальных условий микроэкстракционного извлечения бензойной кислоты

Выбор оптимальных условий осуществлялся в соответствии с дробным двухуровневым многофакторным дизайном эксперимента. Как было показано в главе 1, применение статистических подходов к планированию эксперимента позволяют за минимальное число экспериментов выявить подходящие условия проведения анализа.

На основании экспериментальных и литературных данных, были определены факторы, которые способны оказывать влияние на микроэкстракцию бензойной кислоты. К таким были отнесены: объём экстрагента, объём раствора образца, рН, температура нагревания системы, и наличие или отсутствие высаливающего реагента (сульфат натрия с концентрацией в растворе 1 г/л).

Изначально каждый из этих факторов рассматривался на двух граничных уровнях, значения которых приведены в таблице 5. Для того, чтобы в дальнейшем коэффициенты рассматривать на одном уровне, значения факторов кодировали: «+1» соответствовал максимальному значению из рассматриваемого диапазона, а «-1» - минимальному.