Дипломная работа: Определение бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах с предварительным микроэкстракционным концентрированием

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

направление обучения «Химия»

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

Определение бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах с предварительным микроэкстракционным концентрированием

Студент 4-го курса

Канашина Дарья Леонидовна

И.о. заведующего кафедрой:

д.х.н., проф. Ермаков С.С.

Научный руководитель:

к.х.н., доц. Тимофеева И.И.

Санкт-Петербург 2018

Перечень условных обозначений

АТФ - аденозинтрифосфат или аденозинтрифосфорная кислота

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭЖХ-ДМД - высокоэффективная жидкостная хроматография с диодно-матричным детектированием

ВЭЖХ-УФ - высокоэффективная жидкостная хроматография с фотометрическим детектированием в ультрафиолетовой области

ГЖЖЭ-ВДГ- гомогенная жидкостно-жидкостная экстракция с высаливанием и диспергированием газовой фазой

ГХ - газовая хроматография

ГХ-МС - газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием

ГХ-ПИД - газовая хроматография с пламенно-ионизационным детектированием

ДЖЖМЭ - дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖЖМЭ - жидкостно-жидкостная микроэкстракция

ЖФЭ - жидкофазная экстракция

ЖХ-МС -жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием

ЖХ-УФ - жидкостная хроматография с фотометрическим детектированием в ультрафиолетовой области

ИХ-КД - ионная хроматография с кондуктометрическим детектированием

КР - метод комбинационного рассеяния

КЭ - капиллярный электрофорез

КЭ-КД - капиллярный электрофорез с кондуктометрическим детектированием

КЭ-УФ - капиллярный электрофорез с фотометрическим детектированием в ультрафиолетовой области

ПО - предел обнаружения

СКО - среднеквадратичное отклонение

ТПМ - микроэкстракция на тонкоплёночном силикагеле

ТФМЭ - твёрдофазная микроэкстракция

УЗ - ультразвук

УФ - ультрафиолетовый

ФКТ - фосфоресценция при комнатной температуре

Введение

В настоящее время современную пищевую промышленность практически невозможно представить без использования различного рода консервантов, загустителей, стабилизаторов, вкусовых добавок, красителей. Умеренные дозы данных веществ не оказывают негативного влияния на здоровье человека, однако многие производители не соблюдают установленные нормы, вследствие чего пищевые добавки могут вызывать не только аллергические реакции, но и такое серьёзное заболевание, как астма, или даже являться причиной раковых опухолей [1]. Поэтому контроль их содержания является важной задачей аналитической химии.

Существует множество различных инструментальных способов определения пищевых добавок, основными из которых являются спектрофотометрические, электрофоретические и хроматографические методы [2]. Учитывая, что большинство продуктов питания обладает сложной многокомпонентной матрицей, возникает необходимость в предварительной стадии пробоподготовки, которая обеспечивает выделение и концентрирование аналитов. Наиболее широкое применение для этих целей находят методы жидкостно-жидкостной и твёрдофазной экстракций. Однако, классические варианты этих методов требуют больших объёмов токсичных растворителей, характеризуются сложностью и длительностью выполнения.

Поэтому целью данной работы стало создание нового простого экспрессного селективного и экологически безопасного метода пробоподготовки для определения консервантов в пищевых продуктах - бензойной и сорбиновой кислот, который не требует дополнительного оборудования и легко сочетается с известными системами детектирования.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) оптимизировать условия микроэкстракционного выделения и концентрирования целевых аналитов для их последующего ВЭЖХ-УФ определения; 2) проиллюстрировать возможность разработанной методики на реальных образцах; 3) подтвердить правильность полученных результатов с помощью референтного метода.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Пищевые консерванты

Согласно статье 4 Технического Регламента Таможенного Союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» [3], консервантом является пищевая добавка, предназначенная для продления (увеличения) сроков годности пищевой продукции путем защиты от микробной порчи и/или роста патогенных микроорганизмов.

Наиболее популярной является классификация этих веществ по их происхождению. Как правило, их можно разделить на природные или натуральные и синтетические [4]. К природным консервантам относят столовую соль, уксус, лимонную кислоту, сахар, специи, растительное масло и др. Консерванты синтетического происхождения имеют более распространённое применение при массовом производстве продуктов, по причине их большей эффективности и меньшей стоимости. Согласно Решению Евразийской Экономической комиссии, группа пищевых добавок-консервантов имеет маркировку E200-E299. Наиболее распространённые данные пищевые добавки, их функции, пищевая продукция, при изготовлении которой их наиболее часто применяют, а также максимальное содержание в продукции представлены в таблице 1 [3].

бензойный сорбиновый кислота сок

Таблица 1. Синтетические консерванты, используемые в пищевой промышленности

Механизм действия консервантов различается в зависимости от их структуры и условий реализации. Так, например, при низких значениях pH среды молекулы слабых кислот (бензойная, сорбиновая), а также их солей, не диссоциируют, в таком состоянии они могут диффундировать через плазматическую мембрану бактериальных и грибковых спор. В клетке микроорганизма кислотность среды выше, поэтому молекулы кислот и/или солей распадаются на ионы, происходит накопление анионов и катионов, которые изменяют проницаемость мембран, а также являются токсичными для патогенных микроорганизмов, подавляя их метаболизм и гомеостаз [5]. Сложные эфиры пара-гидроксибензойной кислоты и их соли, известные как парабены, обладают схожим строением с бензойной кислотой, механизм их действия аналогичен описанному выше механизму, но эффективен он при более высоких значениях pH.

Действие диоксида серы (E220) и сульфитов (E221-E228) также зависит от значения кислотности среды. Так, при pH?1,7 активность данных веществ повышена. Они ингибируют цепочки ферментативных реакций, вступая во взаимодействие с АТФ, который является универсальным источником энергии всех биохимических процессов, протекающих в живых организмах. Результатом взаимодействия является подавление реакций обмена веществ, а также блокировка некоторых транспортных систем [1, 6].

Нитраты (E251-E252), как консервирующее средство, действуют в основном в виде нитритов (E249-E250), которые образуются в пищевых продуктах при термической обработке. Принцип действия нитритов основан на образовании из них оксидов азота, реагирующих с аминогруппами ферментов, которые участвуют в расщеплении веществ, обеспечивающих микроорганизмы энергией. Такие реакции оказывают подавляющее действие на эти ферменты [7].

Несмотря на полезные свойства консервантов, за счёт которых их используют при изготовлении пищевых продуктов, они способны оказывать негативное воздействие на здоровье человека.

Бензойная кислота и её соли не всегда безвредны для здоровья человека даже в тех количествах, в которых они присутствуют в продуктах питания. Поэтому специалисты не рекомендуют часто употреблять в своём рационе, например, газированные напитки, майонезные или томатные соусы. В небольших количествах при частом потреблении данный консервант способен спровоцировать аллергические реакции, следствием которых становятся серьёзные заболевания кожных покровов (крапивница), дыхательных путей (астма, ринит) [8], а также известны случаи увеличения гиперактивности [9]. При превышении допустимой нормы могут возникать более критичные последствия: нарушение когнитивных функций, нейротрансмиссии [10], развитие ацидоза, судорог и гиперпноэ [11]. Помимо вышеперечисленного, консерванты под кодом E210-E213 способны вызывать развитие онкологических заболеваний. Это происходит вследствие образования канцерогенного бензола - продукта реакции бензойной кислоты с витамином С (аскорбиновая кислота) [12]. Бензол является мутагеном, под действием которого изменятся митохондриальная ДНК, что и провоцирует раковые заболевания.

Сорбиновая кислота и её производные менее токсичны для человека, однако были выявлены случаи, в которых она является инициатором аллергических реакций, в том числе дерматита [13]. Известно также, что при попадании в организм человека в больших количествах пищевые добавки данной группы способны разрушать витамин B12, дефицит которого может стать причиной развития анемии, а также и различных неврологических расстройств [14].

Помимо аллергического воспаления кожных покровов, парабены обладают мутагенной активностью, провоцирующей рак молочной железы [15, 16]. К тому же, эти консерванты негативно воздействуют на эндокринную систему, вмешиваясь в функционирование такого гормона, как эстроген [17].

Пищевые добавки E220 - E228 относят к третьему классу опасности. Продукты, содержащие данные вещества, особенно противопоказаны людям, которые имеют предрасположенность к астме [18]. В концентрациях, превышающих норму, сульфиты способны оказывать пагубное влияние на дыхательную систему любого человека, вызывая такие заболевания как ринит, респираторный дистресс и другие [8, 19]. Кроме того, встречались случаи, когда диоксид серы являлся причиной непереносимости некоторых видов пищевых продуктов [20].

Негативное влияние нитратов заключается в том, что они имеют способность в мясных продуктах восстанавливаться до нитритов в присутствии нитратредуктазы. Нитриты, в свою очередь, под действием желудочного сока превращаются в N - нитрозoсоединения, которые являются канцерогенами и мутагенами [21, 22].

Таким образом, можно сделать вывод, что консерванты способны оказывать негативное влияние на здоровье человека не только в концентрациях, превышающих норму, но и в незначительных количествах. Поэтому контроль их наличия и содержания является важной задачей для химиков-аналитиков.

1.2 Методы определения бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах

В настоящее время разработано большое количество инструментальных методик определения синтетических консервантов в пищевых продуктах: электрокинетических [23, 24], спектрофотометрических [25-27], а также хроматографических [28-30].

Среди электрокинетических методов широкое распространение получил капиллярный электрофорез (КЭ). Метод основан на электромиграционном перемещении заряженных частиц, а также на электроосмосе раствора-носителя. На рисунке 1 показано разделение смеси двух компонентов (отрицательно заряженных) при помощи капиллярного электрофореза. В раствор-носитель (чаще всего это буфер) вводится анализируемый раствор, вдоль тонкого капилляра прикладывают электрическое поле, в результате чего возникает пассивное перемещение жидкости и движение заряженных частиц, а поскольку электромиграционные параметры различны для каждого сорта частиц, то проба разделяется на индивидуальные компоненты. Эффективность такого разделения достаточно высокая, это обуславливается тем, что такие мешающие факторы, как диффузия, сорбция, конвекция, перепад температур и другие в капилляре минимальны, так как внутренний радиус таких капилляров находится в диапазоне от 20 до 100 микрометров [31]. Для определения компонентов используются различные детекторы: спектрофотометрические, флуоресцентные, электрохимические.