Внешняя мембрана проспоры имеет ориентацию, противоположную ориентации внутренней мембраны проспоры. Ориентация внешней мембраны проспоры «изнутри - наружу» была продемонстрирована с помощью изолированных проспор, которые могут легко окислять NADH и
гидролизовать ATP, если эти субстраты добавляются в среду.
После поглощения проспоры процесс споруляции становится необратимым, и обогащение среды уже не способно его остановить (Freese et al, 1970).
На стадии IV начинается образование кортекса между внутренней и внешней мембранами проспоры. В это время спора начинает сильно преломлять свет, что хорошо заметно при микроскопировании. Такую спору называют рефрактильной. Развитие кортекса, вероятно, продолжается и на следующей стадии. За стадией IV, в течение стадии V, происходит конденсация белков внутренней споровой оболочки на поверхности внешней мембраны проспоры. Внутренняя оболочка споры представляет собой сложно организованную многослойную структуру.
Внешняя оболочка споры конденсируется на поверхности внутренней оболочки в течение стадии VI. Итак, споровая оболочка - это сложная структура, состоящая из белкового внешнего слоя (внешняя оболочка споры) и
пластинчатого внутреннего слоя (внутренняя оболочка споры). По мере развития споровой оболочки спора становится все более устойчивой к химическим реагентам и нагреванию. Созревание споры происходит на стадии
VI, и за ним, на стадии VII, следует освобождение зрелой споры от материнской клетки.
Были выделены мутанты, у которых блокировалось наступление различных морфологических стадий. Эти мутанты обозначены как spoO, spol, spoIII, spoIV, spoV и spoVI в зависимости от номера последней морфологической стадии развития, которая у них имеет место.
Точное время начала споруляции в лабораторных условиях зависит от штамма Bacillus и используемой среды. Для штамма В. subtilis Marburg на
21
модифицированной среде Шеффера (Leighton et al, 1971). Споруляция инициируется в период То и к периоду Т5 в материнской клетке можно видеть рефрактильные споры. Аналогичная картина споруляции наблюдается, когда клетки переносят с богатой ростовой среды на минимальную среду более определенного состава. Споруляция происходит наиболее синхронно и эффективно, если клетки до инициации споруляции выращивали в богатой среде минимум шесть или семь генераций.
С определенными стадиями споруляции связано появление конкретных ферментов и функций; в настоящее время ясно, что некоторые из этих ферментов не вовлечены непосредственно в споруляционный процесс. Для того чтобы убедиться в этом, были получены делеционные мутанты по генам,
кодирующим такие ферменты, и у этих мутантов изучена способность к споруляции. В случае субтилизина и нейтральной протеазы споруляция не нарушается при полном отсутствии этих ферментов (Kawamura et al, 1984).
Возможно, что не все внеклеточные ферменты, которые синтезируются в процессе споруляции, требуются для этого процесса, хотя их синтез может частично быть под тем же контролем, что и синтез истинных споруляционных продуктов. Все же полезно использовать эти ферменты и их функции как легко идентифицируемые маркеры споруляционного процесса.
22
Глава 2 Места обитания бактерий рода Bacillus
2.1 Почва
Главной средой обитания бактерий, принадлежащих к видам Bacillus,
является почва - штаммы этих бактерий были выделены даже из образцов почвы, взятых в местообитаниях с экстремальными условиями - в пустыне и в Антарктике. Обычно разнообразие бактерий в почвах с низким содержанием органических веществ достаточно ограничено. В них доминируют В. subtilis, В. licheniformis и В. cereus. Однако по мере повышения плодородия почвы разнообразие видов увеличивается.
Особенно успешным для изучения почвенных бактерий в различных почвах было применение метода нумерической таксономии (Goodfellow et al, 1985). Отбирая образцы почвы, следует помнить, что термофильные бактерии,
например, не обязательно обитают только в термальных источниках, а
алкалофильные бактерии - в почвах с высокими значениями рН. Из обычной почвы можно выделить разнообразные штаммы бацилл, способных расти при значениях рН, превышающих 10 (Aunstrup et al, 1972), а клетки В. stearothermophilus могут быть выделены из почв районов с умеренной температурой. В то же время экстремальные термофилы, а также ацидофильные штаммы В. acidocaldarius встречаются исключительно в термальных источниках и окружающих их почвах (Логинова и др., 1978).
Некоторые галоалкалофильные бациллы обитают, скорее всего, исключительно в щелочных соленых озерах. Поэтому бактерии с экстремальными свойствами,
такими как устойчивость к высокой температуре или рН, лучше искать в образцах, взятых в экзотических условиях. Тем не менее, если использовать соответствующие условия обогащения и выделения, то и из обычной почвы также можно выделить большое количество различных таксонов. Об этом говорит и частота выделения новых видов из обычных почв (цитир. Харвуд, 1992).
23
2.2Вода
2.2.1Морская вода
Клетки бацилл могут составлять до 20% общей численности гетеротрофной микрофлоры морской воды. Хотя имеются сообщения о еще более высоких цифрах, но в среднем численность бацилл составляет около 9%.
Более высокая численность бацилл характерна для прибрежных вод, причем она возрастает с увеличением температуры и глубины и уменьшается с удалением от берега. Это, по-видимому, отражает «вымывание» почвенных бактерий в море. Береговое происхождение этих бактерий подтверждается выделением термоактиномицетов из морских течений, эстуариев, прибрежных участков морей и районов открытого моря (Cross, 1981; Attwell, Colwell, 1984).
В морской воде преобладают, по-видимому, клетки В. licheniformis, вторыми по численности идут клетки В. subtilis и, в незагрязненных образцах, В. pumilus. К
другим видам, встречающимся более редко и в основном в незагрязненных районах, относятся В. brevis, В. firmus и В. sphaericus. В морских осадочных отложениях обычно наблюдается большее разнообразие бацилл по сравнению с водной толщей, и процентное содержание их там составляет от 14 до 80%
суммарного количества гетеротрофных бактерий. В этом случае частота встречаемости зависит также от расстояния до берега и от уровня загрязненности: В. subtilis и В. pumilus преобладают в загрязненных прибрежных водах, а в незагрязненных районах встречается еще В. cereus. В
океанических осадках обнаружено большое, разнообразие бацилл; кроме перечисленных видов из них были выделены В. firmus и В. licheniformis (Bonde et al, 1981). Количественные исследования осадков из Северного моря,
проведенные Буайе и Хертцом, показали, что в них преобладают штаммы В. subtilis, В. licheniformis и В. firmus.
Большинство морских штаммов Bacillus, судя по всему, соответствуют стандартным видам и не имеют каких-либо особых признаков. Однако
24
некоторые виды характерны только для этой среды, таковы, в частности,
организмы, близкородственные В. firmus и классифицированные Бонде как штаммы «М» (Bonde, 1981). Другие морские бактерии, такие как «В. epiphytus», «В. filicolonicus» и «В. cirroflagellosus», не имеют определенного таксономического положения (Zobell et al, 1944).
Со штаммами, выделенными из соленых маршей и ила эстуариев,
возникает в настоящее время таксономическая проблема. Колонии этих бактерий часто окрашены в оранжевый, желтый или розовый цвет, вероятно,
они являются вариантами В. firmus и В. lentis. Хотя они были описаны как
«спектр» штаммов, однако недавние исследования методом нумерической таксономии позволили предположить, что они относятся к нескольким отдельным таксонам, родственным В. firmus (Logan, Berkeley, 1981; Priest et al, 1988).
2.2.2 Пресная вода
Бациллы, обнаруживаемые в пресной воде, в основном имеют, вероятно,
почвенное происхождение. Бактерии рода Bacillus встречаются чаще всего в осадках и представляют собой типичные почвенные организмы, такие как В. megaterium, В. cereus, В. firmus и В. pumilus (Allen et al, 1983).
Особый интерес представляют термофильные бациллы, выделенные из горячих источников и других термальных пресных вод. К ним относятся В. acidocaldarius и чаще встречающиеся В. stearothermophilus, «В. thermodenitrificans», В. coagulans и «В. thermocatenulatus» (Головачева и др., 1975; Wolf, Sharp, 1981).
2.3 Животные и человек
За исключением сибиреязвенной бациллы, бациллы не обладают большой патогенностью для млекопитающих. Bacillus cereus вызывает ряд оппортунистических инфекций (осложняющих другие заболевания) - чаще
25