полученной суспензии. Суспензии выдерживают при комнатной температуре,
результаты учитывают через 1 час или 24 часа инкубирования.
Протеаза. Способность бактерий минерализовать белки является таксономическим признаком и определяется по разложению желатина или пептонизации казеина. Тестирование на протеолитическую активность проводят на молочном агаре. Гидролиз желатина изучают на чашках Петри,
которые предварительно заливают голодным агаром, а затем – 25%
мясопептонным желатином.
Амилаза. Для определения амилолитической активности используют крахмальный агар, который после стерилизации разливают в чашки Петри. В
готовую среду уколом наносят исследуемые культуры. Продолжительность культивирования от 3 до 5 дней. Гидролиз крахмала выявляется по зоне просветления вокруг укола, которая четко видна после обработки раствором Люголя.
Липаза. Активность липазы определяют на трибутириновом агаре,
который готовят из расчета 20 гр. на 1 л. воды. После стерилизации среду охлаждают до 800С, добавляют трибутирин и перемешивают на магнитной мешалке в течение 2-3 часов до полной гомогенизации. Затем сразу заливают в чашки Петри. На застывшие агаровые пластинки уколом наносят культуры.
Время инокуляции составляет 5 дней. В результате по зонам просветления судят о липазной активности.
Нитратредуктаза. Восстановить нитраты до нитритов способны микроорганизмы, образующие фермент нитратредуктазу и использующие нитраты в качестве источника азота. В среду засевают клетки исследуемого организма, выдерживают в термостате 7-10 дней. При добавлении реактива Гисса происходит окрашивание клеточной суспензии в красно-розовый цвет за счет того, что в кислой среде в присутствии нитратов и ароматических аминов происходит образование азотистых соединений (Суслова, 2007).
51
Глава 6 Роль микроорганизмов рода Bacillus в биодеградации сложных органических соединений и растворении соединений кремния
6.1Деградация углеводородов бактериями рода Bacillus
Впоследние десятилетия возрос интерес к микроорганизмам -
деструкторам различных высокомолекулярных соединений. Загрязнение окружающей среды нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) является проблемой мирового масштаба и в настоящее время остается одной из сложных и многоплановых в экологии и охране окружающей среды. Разрабатываются различные методы очистки от нефтяных загрязнений: механические, физико-химические,
биологические. В настоящее время подготавливаются микробиологические методы, основанные на использовании ферментативной активности микроорганизмов - деструкторов, использующих высокомолекулярные соединения в качестве единственного источника углерода (Процессы биодеградации в нефтезагрязненных почвах, 2004). Микробиологическая деградация ПАУ является основным процессом, приводящим к очистке от этих соединений водоемов и почв. Катаболическим потенциалом в отношении ароматических углеводородов обладают бактерии рода Bacillus. Бациллы способны полностью утилизировать или частично трансформировать такие соединения, как нафталин, салицилат, ортофталат, октан и др., наряду с псевдомонадами, артробактериями и родококками (Звягинцева, 2001;
Плотникова и др., 2001; Zhuang et al, 2002).
Полициклические ароматические углеводороды - большая группа широко распространенных загрязнителей окружающей среды. Эти соединения обладают мутагенными и канцерогенными свойствами и представляют значительную потенциальную опасность для здоровья человека. Именно поэтому изучение биодеградации, микробного метаболизма и детоксикации
52
этой группы химических соединений привлекло внимание большого количества ученых во многих странах. Углеводороды и аналогичные им битуминозные вещества поступают в водоемы вместе с растительными остатками, а также в виде нефтяных и других промышленных загрязнений
(анионные ПАУ). Распад их в водной массе и донных отложениях возможен лишь при участии микроорганизмов (Андрусенко, 1967)
Как показывают исследования, биодеструкторами различных высокомолекулярных соединений являются бактерии рода Bacillus.
Способность к биодеградации описана для многих штаммов данного рода:
Bacillus naphtovorans (Zhuang et al, 2002), B. benzoevorans, B. gordanae.
Полициклические ароматические углеводороды представляют большой разнообразный класс органических соединений, молекулы которых состоят из трех и более ароматических колец в различных структурных конфигурациях.
Стабильность углеводородов зависит от числа ароматических колец. Например,
в почве молекула фенантрена с тремя кольцами может сохраняться от 16 до 126
дней, в то время когда с пятью - от 229 до 1400 дней (Kanaly et al, 2002).
Нефтяные углеводороды в основном, относятся к парафиновому ряду с прямой,
незамкнутой цепочкой или к нафтеновому с насыщенным водородом циклическим ядром. Анионные ПАУ, как известно, характеризуются выраженным антибактериальным действием и могут вызывать лизис клеток.
Однако некоторые бактерии не только проявляют высокую устойчивость к этим веществам, но и способность разрушать и использовать их. Также известно, что ферменты, участвующие в процессах разложения высокомолекулярных веществ, защищены от температурного воздействия как низких, так и повышенных температур (7, 37 и 500С). Так, например,
большинство штаммов B. stearothermophilus, способных окислять фенол, было изолировано из мест, прогреваемых паротермальными газами (56-580С), в
которых из органических соединений присутствуют фенолы и смолы
(Головачева и др., 1975).
53
Среди основных факторов, влияющих на доступность углеводородов для бактериального окисления, необходимо выделить следующие: относительная растворимость углеводорода в среде, пригодность углеводорода к активному транспорту через клеточную мембрану, отсутствие специфического токсического действия на цитоплазму самого углеводорода или продуктов его окисления, а также наличие у микроорганизмов соответствующей системы ферментов.
Процесс самовосстановления биоценозов, загрязненных нефтью, по мнению большинства исследователей, идет более 10-25 лет. Являясь сложной многокомпонентной системой, нефть доступна для полной утилизации только микроорганизмам, обладающим уникальными ферментными системами.
Пример: экспериментальная работа по биодеградации полициклических ароматических углеводородов, природных компонентов нефти, была проведена для культур Bacillus, выделенных из воды и донных осадков озера Байкал. Было установлено, что «байкальская нефть» представляет собой сложную смесь неразделяемых полициклических углеводородов. Она представлена только высококипящими фракциями и содержит 70,26% углеводородов. В составе последних преобладают насыщенные углеводороды, они составляют 48,14%,
ароматические - 22,12%.
Изучение распространения углеводородокисляющих микроорганизмов показало, что их распространение в исследованном районе пятнистое.
Количество культивируемых углеводородокисляющих микроорганизмов в районе самого нефтяного пятна незначительно - до 100 кл/мл, число гетеротрофов, в основном представленных бактериями рода Bacillus, достигло
300 кл/мл. Возможно, это объясняется токсическим действием нефти на клетки микроорганизмов и сохранением спор бацилл, устойчивых к неблагоприятным условиям. По мере удаления от места нефтепроявления количество нефтеокисляющих бактерий увеличивается от 200 до 1000 кл/мл.
Также установлено, что в поверхностных пробах воды в районе нефтепроявления численность бактерий, разрушающих углеводороды,
54
колеблется от 13 до 2608 кл/мл. В придонных слоях численность возрастает до
20 тыс. кл/мл. Выделенные микроорганизмы были отнесены к родам
Pseudomonas, Rhodococcus, Bacillus и в этой экологической нише бациллы становятся доминирующей группой.
Для пяти штаммов Bacillus, был проведен эксперимент по деградации трех ПАУ (пирена, финантрена и флуорантена). Эти полициклические углеводороды преобладают в твердой фазе аэрозоля, собранного в зимний период.
В результате проведенных исследований установлено, что в присутствии бактерий рода Bacillus, в условиях модельного эксперимента, биодеградация ПАУ составляла 18-30% за исключением штамма № 38 отнесенного к Bacillus sp., где конверсия не превышала 2%, причем фенантрен в данных условиях сохранился полностью (Суслова, 2007).
6.2 Деградация бис-(2-этилгексил)фталата бактериями рода Bacillus
Диэфиры орто-фталевой кислоты (фталаты) - широко распространенные продукты крупнотоннажных химических производств, применяющихся в основном в качестве пластификаторов при изготовлении полимерных материалов.
Начиная с 50-х годов прошлого столетия, производство фталатов в мире непрерывно росло, и в последнее десятилетие достигло уровня миллионов тонн в год. Из нескольких десятков производимых в промышленных масштабах фталатов ведущее место принадлежит бис-(2-этилгексил)фталату (БЭГФ).
БЭГФ является внешним пластификатором и не образует химических связей с полимером, поэтому он способен постепенно мигрировать из пластмасс в окружающую среду. Это соединение отличается термо- и фотостабильностью,
устойчивостью к химическому гидролизу и относительно высокой для гидрофобных веществ растворимостью в воде (до 1 мг/л) (Giam et al, 1984).
55