Признак |
B.pumilus |
|
|
Каталаза |
+ |
|
|
Реакция Фогес-Проскауэра |
+ |
|
|
Рост в анаэробномагаре |
- |
|
|
Рост при 50° С |
+ |
|
|
Рост при NaCl 7% |
+ |
|
|
Образование кислоты и газа в результате |
- |
расщепления глюкозы |
|
|
|
Редукция NO3 до NO2 |
- |
|
|
Гидролиз крахмала |
- |
|
|
Рост при 65° С |
- |
|
|
Ширина клеток шире 1,0 мкм |
- |
|
|
рН в реакции Фогес – Проскауэра < 6.0 |
+ |
|
|
Образование кислоты в результате расщепления |
+ |
глюкозы |
|
|
|
Гидролиз казеина |
+ |
|
|
Параспоральные тела |
- |
|
|
Кроме того, в международном генном банке зарегистрирован 3779 фрагмент последовательностей гена 16S рибосомальной РНК, которые отнесены к роду
Bacillus. Так же получены полные геномы для 38 штаммов бацилл
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
46
4.2 Некоторые способы получения накопительных культур для селективного выделения штаммов Bacillus
Организм |
|
Способ получения |
B. acidocaldarius |
|
Среда с рН 4, инкубация при |
|
|
600С |
B. alcalophilus |
|
Высев на питательный агар с |
|
|
рН 8,5-11 |
B. azotofixans |
|
Агаризованная среда, не |
|
|
содержащая N, с тиамином и |
|
|
биотином |
B. azotoformans |
|
Среда с пептоном, инкубация |
|
|
в атмосфере N2O |
B. coagulans |
|
Накопительная культура в |
|
|
питательном бульоне с |
|
|
глюкозой при рН 5,5 и 500С. |
|
|
Инкубация чашек Петри с |
|
|
той же средой при 500С |
B. fastidiosus |
|
Минимальная среда с |
|
|
мочевиной или аллантоином |
|
|
в качестве единственного |
|
|
источника С и N |
B. firmus |
|
Среда с агаром на морской |
|
|
воде, инкубация при 220С в |
|
|
течение 7 дней |
B. licheniformis |
|
Накопительная культура на |
|
|
среде с пептоном и нитратом |
|
|
в анаэробных условиях |
B. megaterium |
|
Минимальная среда с |
|
|
глюкозой и нитратом в |
|
|
качестве единственного |
|
|
источника N |
B. pantothenticus |
|
Накопительная культура в |
|
|
питательном бульоне, |
|
|
содержащем 4% NaCI, |
|
|
инкубация при 30С |
B. pasteurii |
|
Среда, содержащая |
|
|
дрожжевой экстракт, |
|
|
(NH4)SO4 и 5% мочевины, рН |
|
|
9. Инкубация в аэробных |
|
47 |
|
|
условиях. |
|
|
B. polymyxa |
Среда с пептоном и |
|
крахмалом в пробирках с |
|
дюрхемовскими трубками. |
|
Должно наблюдаться |
|
выделение газа |
B. sphaericus |
Среда, содержащая аргинин в |
|
качестве единственного |
|
источника углерода и азота. |
|
Стрептоцин используется как |
|
селективный фактор для |
|
выделения патогенных для |
|
насекомых штаммов |
B. stearothermophilus |
Различные среды, инкубация |
|
при 650С |
48
Глава 5 Изучение Bacillus в водной среде
5.1 Выделение чистых культур из водных образцов
Для выделения бацилл из водных образцов используют метод прямого глубинного посева 1-2 мл. исследуемой воды (Родина, 1965); из донных осадков образцы обрабатывают согласно следующей методике. Образец исследуемого донного осадка в количестве 0,5 гр. берут лопаткой,
обработанной спиртом, и стерильно вносят в колбу емкостью 100 мл. с 50 мл.
стерильной дистиллированной воды. В течение 30 мин. грунт встряхивают на качалках со скоростью 150 об./мин. при амплитуде 5. После этого суспензии дают отстояться и используют ее для разведений.
При выделении и учете количества бактерий исследуемой группы используют чашечный метод Коха. Сущность данного метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии на плотную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колоний. Полученную суспензию и разведения в количестве 1 мл. вносят в чашки Петри, заливают стерильной питательной средой РПА:10 с добавлением сульфата марганца.
Культивирование посевов проводят при температурах 40, 250 и 370С.
Выделение споровой стадии бацилл. Для выделения споровой стадии бацилл перед посевом водные образцы и суспензии донных отложений пастерилизуют (10 мин. при 60-750С), чтобы убить вегетативные клетки и оставить жизнеспособные споры. Посев осуществляют на РПА:10. Отбор колоний проводят по морфологическим признакам, характерным для представителей рода Bacillus.
Выделение термофильных бацилл. При выделении термофильных бацилл используют метод накопительной культуры. Термофильные бактерии культивируют и выделяют, применяя селективные среды, при температуре
530С.
49
Идентификация культур. Морфологический анализ. Штаммы микроорганизмов идентифицируют согласно методике, предложенной Дж. Р.
Норрисом с соавторами (Norris et al, 1981). Суточные чистые культуры окрашивают по Граму. При обычных способах окраски по Граму споры либо не прокрашиваются, либо прокрашиваются очень слабо, т.к. оболочка споры состоит из нескольких покровов и кортекса и имеет вид светлых включений на фоне окрашенной плазмы (Суслова, 2007).
Биохимические тесты. Идентификацию бактерий до вида проводят после изучения следующих признаков: наличие у чистых культур микроорганизмов амилазы, нитратредуктазы, протеазы, выявление пигментообразования, способность роста при 650С, при 500С, на РПА с 7% NaCl, а также в анаэробных условиях. Обязательным признаком в идентификации является V-P реакция. Необходимо учитывать наличие параспоральных тел в спорангии, которые определяют принадлежность к энтопотагенным видам рода Bacillus (Краткий определитель Берджи, 1980).
Определение ферментативной активности. Каталаза. Каталазную активность выявляют следующим образом: исследуемую культуру выращивают на поверхности плотной питательной среды, на которую затем наносят каплю
10% раствора перекиси на колонию. Выделение кислорода, хорошо заметное по образованию пузырьков газа, свидетельствует о продукции клетками каталазы
(Практикум по микробиологии, 1976).
Фосфотаза. Для определения фосфатазной активности используют стандартный набор реагентов ALKALINE PHOSPHOTASE «FL». Стандартный набор реагента, содержащий n-нитрофенилфосфат, капают в планшетки по 0,25
мл. в каждую лунку, когда вносят биомассу исследуемых культур в размере 1
бактериальной петли. При положительной реакции, т.е. при действии бактериальной щелочной фосфотазы, n-нитрофенилфосфат расщепляется на n-
нитрофенол и фосфат, о чем свидетельствует желтая окраска индикатора.
Фосфотазную активность оценивают по интенсивности желтой окраски
50