Эксперименты in vivo были проведены с разрешения этического комитета ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России (протокол №2 от 26.05.2016г.), с согласия больных на участия в клинических исследованиях, при соблюдении законов Российской Федерации и нормативно-правовых международных актов, ратифицированных в нашей стране в сфере проведения научных исследований: Хельсинская Декларация Всемирной ассоциации "Этические принципы проведения научных исследований с участием человека (1964) с с поправкой 2000 года; Директива 2010/63/ЕИ Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях (Статья 27) от 22.09.2016; "Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных"; приказ Минздрава РФ №200-Н "Об устранении правил надлежащей клинической практики" от 01.04.2016 г.
За основу была взята модель язвы желудка, описанная ранее Е.Ф. Чередниковым (1998). Методика воспроизведения модели заключалась в следующем: собакам под общим наркозом во время проведения эзофагогастроскопии вводили 96% этиловый спирт в количестве 3,0 мл путём инъекции в подслизистый слой стенки желудка в области антрального отдела по малой кривизне как наиболее частой локализации язв желудка. После этого внутривенно делали инъекцию раствора винкристина из расчёта 0,01 мг/кг массы животного. Одновременно с введением винкристина внутривенно вводили раствор гепарина из расчёта 100 ЕД/кг массы животного. На 4 сутки у всех собак воспроизводилась типичная язва желудка, округлой формы, с неглубоким язвенным дефектом 1,0 см в диаметре, с выраженным воспалительным валом вокруг и фибрином на дне. Эндоскопическая картина, наблюдаемая в процессе воспроизведения и заживления язв, была идентичной для всех животных, что сопоставимо с результатами других авторов (А.В. Попов, 2013; А.Р. Баткаев,2010). Травмирование слизистой оболочки краёв и дна язвы биопсийными щипцами позволяло вызвать из язвы умеренное кровотечение.
Животные содержались в идентичных стационарных условиях вивария. Каждой собаке воспроизводили по две кровоточащие язвы желудка (одна - опытная, другая - контрольная). Таким образом, на 30 язвах желудка у собак были проведены все экспериментальные исследования.
В опытных язвах гемостаз и лечение проводили порошкообразными желпластаном и лиофилизатом новосэвен в комбинации с диовином. Лечение начинали сразу после воспроизведения кровотечения из моделированных язв. Повторную лечебную эндоскопию в опытных язвах проводили с интервалом 3-4 дня по разработанной методике.
В контрольных язвах желудка измеряли время самопроизвольной остановки кровотечения и сроки заживления язвенных дефектов.
При эндоскопических исследованиях определяли время остановки кровотечения в опытных и контрольных язвах, признаки возобновления кровотечения, оценивали влияние местных гемостатических средств и гидрогеля на скорость и репаративную регенерацию экспериментальных язв. Биопсийными щипцами определяли размеры язвенных дефектов, учитывая величину "шага" максимально развернутых браншей их, составляющую от 0,5 до 1,2 см в зависимости от марки эндоскопа.
Биопсию проводили во время каждой эндоскопии (через 2-3 дня). Биоптаты слизистой из дна и краев язвенных дефектов служили образцами для морфологических исследований.
Весь материал обрабатывали 10% раствором нейтрального формалина, после чего заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм депарафинировали, приготовляли гистологические срезы и окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону, ретикулиновые волокна - с использованием азотно-кислотного серебра, при помощи ЩИК-реакции выявляли нейтральные гликопротеиды. Окрашенные срезы микроскопировали при увеличении х 100 и х 400, клеточный компонент соединительно-тканной стромы слизистой исследовали при увеличении х 900 с использованием иммерсионного масла.
Изучение срезов проводили методом световой микроскопии, подсчитывая общее число, а также состояние клеточных элементов соединительно-тканной стромы: эозинофилы, моноциты (гистоциты), нейтрофилы, лимфоциты, базофилы, а также фибробласты. В морфологической части работы проводили консультации с профессором В.И. Даниленко.
Во втором направлении (клинические исследования) было обследовано и пролечено 115 больных с кровотечениям из гастродуоденальных язв, находившихся на лечении в хирургических отделениях БУЗ ВО "ВГКБСМП №1".
Среди больных женщин 41 (35,66%), мужчин - 74 (64,34%). Возраст больных колебался от 22 до 91 лет и в среднем составил 59,14±14,98 (М±у) лет. Больных пожилого и старческого возраста (старше 60 лет по рекомендациям ВОЗ) было 59 (51,3%) человек.
По характеру источника кровотечения пациенты распределялись в следующем порядке:
· Острые симптоматические язвы желудка и ДПК - у 74 (64,34%) больных;
· Язвенная болезнь желудка и ДПК - у 38 (33,06%) больных;
· Язва гастроэнтероанастомоза - у 3 (2,6%) больных.
Особенностью больных с выявленными острыми симптоматическими язвами желудка и ДПК явилось: пожилой и старческий возраст, наличие основного или сопутствующего соматического заболевания в стадии декомпенсации, длительный приём антиагрегантов, антикоагулянтов, НПВП и др.
Острые язвенные дефекты чаще всего располагались в желудке, не сочетались с активным гастритом, не имели чёткой локализации. При этом язвенные дефекты на почве язвенной болезни, как правило, сочетались с активным гастритом или дуоденитом и имели определённую локализацию. Размеры язвенных дефектов колебались от 0,4 до 2,8 см в диаметре. У 12 (10,4%) больных отмечалось наличие нескольких дефектов в желудке или ДПК, у 11 (9,6%) больных наблюдалось сочетанное язвенное поражение желудка и 12 ДПК, а у 19 (16,5%) больных выявлены множественные эрозивно-язвенные поражения гастродуоденальной зоны, что потребовало дополнительного лечения.
При эндоскопическом исследовании (ЭФГДС) была использована общепринятая классификация по J. Forrest (1974): FIA-FIB - 24 (20,86%) чел. (основная группа - 12 пациентов, группа сравнения - 12), FIIA-FIIB - 56 (48,69%) чел. (основная группа - 30 пациентов, группа сравнения - 26). FIIC - 35 (30.43%) чел. (основная группа - 17 пациентов, группа сравнения - 18).
Для определения степени тяжести кровотечения использовалась классификация по А.И. Горбашко (1985), согласно которой больные распределились следующим образом: тяжелая степень тяжести геморрагии была отмечена - у 28 (24,4%) больных, средней тяжести - у 38 (33%) больных и легкая степень кровотечения была выявлена у 49 (42,6%) больных.
В соответствии с задачами клинического исследования все пациенты были разделены на основную группу и группу сравнения. При проведении исследования использовался метод случайной выборки (Н.Г. Филиппенко, С.В. Поветкин, 2010).
В основную группу вошли 59 больных, их средний возраст составил 60,08±15,67 (М±у) лет. В группу сравнения вошли 56 больных, их средний возраст составил 58,26±14,98 (М±у) лет.
У больных основной группы при продолжающемся кровотечении (FIA-FIB) использовали комбинированный метод эндоскопического гемостаза: вначале производились аргоно-плазменная коагуляция или инъекционный метод обкалыванием аминокапроновой кислотой и сосудосуживающими препаратами, а затем на область дефекта с помощью инсуффлятора наносили порошкообразные гемостатики желпластан с лиофилизатом новосэвен в равных количествах по 0,1 г каждый с расстояния 1,0 см от кровоточащего дефекта и гранулированный сорбент диовин 0,3 г с расстояния 1,5 см от язвенной поверхности (Патент РФ №2633588).
У больных с типом кровотечения FIIA вначале производили аргоно-плазменную коагуляцию тромбированного сосуда, а затем на эту область инсуфлировали желпластан с лиофилизатом новосэвен и последующим нанесением диовина по разработанной методике. У больных основной группы с типом кровотечения FIIB также вначале осуществляли аргоно-плазменную коагуляцию либо через сгусток, либо после отмывания последнего осуществляли коагуляцию тромбированного сосуда. После этого лечебная эндоскопия всегда заканчивалась комбинированной пневмоинсуффляцией гемостатических средств и гранулированного сорбента по разработанной методике.
Всем больным после остановки кровотечения (типа FIA-FIB) и с признаками неустойчивого гемостаза (тип FIIA-FIIB) повторную ЭФГДС производили в течение 12 часов после первичного осмотра (эндоскопический мониторинг). Больным основной группы дополнительно проводили при этом профилактику рецидива кровотечения с нанесением гемостатических средств и гранулированного сорбента по предложенной методике.
У больных с типом геморрагии FIIC для профилактики возобновления кровотечения осуществляли нанесение на область дефекта желпластана и диовина в равных количествах по 0,2 г каждый с расстояния 1,0 см от язвенного дефекта. Местное лечение осложнённых гастродуоденальных язв осуществляли с интервалом 4-5 дней.
Пациенты группы сравнения и основной группы по возрасту, полу, размером обусловливающих кровотечение дефектов, сопутствующим заболеваниям, продолжительности наблюдения были сопоставимы.
В группе сравнения применяли общеизвестные способы эндоскопического гемостаза (аргоно-плазменная коагуляция, диатермокоагуляция, инфильтрационные методы обкалывания аминокапроновой кислотой, сосудосуживающими препаратами и др.) без использования порошкообразных гемостатических средств и гранулированных сорбентов.
В комплексном лечении пациенты обеих групп получали общую гемостатическую, инффузионную, патогенетическую, симптоматическую и противоязвенную терапии. Из противоязвенного лечения все больные получали ингибиторы протонной помпы (нексиум, омез, омепразол) виде инфузомата с последующим переходом на пероральный приём препаратов.
Всем больным при поступлении проводилась неотложная ЭФГДС, выполнялись УЗИ органов брюшной полости, электрокардиография, рентгенограмма легких, рН-метрия и другие методы обследования. Всем пациентам производили лабораторные исследования: общий анализ крови, свёртывающая система крови, биохимические исследования крови, определение группы крови и резус-фактора, морфологические и бактериологические исследования биопсийного материала.
Эффективность лечения больных с язвенными желудочно-кишечными кровотечениями оценивали по следующим клиническим и эндоскопическим показателям: критерии надежности гемостаза (кровь и ее следы в просвете желудка и в области язвенного дефекта), частота возобновления кровотечения при повторных ЭФГДС, оценка скорости и динамика репаративных процессов в язвенных дефектах, частота рецидивов кровотечения на фоне проводимого лечения, предотвращение экстренных операций, показатели летальности, сроки госпитализации.
Статистическую обработку результатов исследования проводили в пакете программ MS Excel. Рассчитывали: среднее, моду, медиану, стандартное отклонение, средние отклонение, верхний и нижний квартили, минимальное и максимальное значение. Статистическую значимость различий проводили с использованием методов Колмогорова-Смирнова (для независимых групп) и Вилкоксона (для зависимых групп), рангового дисперсионного анализа Фридмана. По качественным признакам оценку различий между группами производили с использованием точного критерия Фишера и Z-критерия с поправкой Йетса (О.Ю. Реброва, 2002).
Результаты собственных исследований
Экспериментальный раздел. Экспериментальные исследования комбинированного применения гемостатических средств (желпластана и лиофилизата новосэвен) и гранулированного сорбента (диовин) при кровотечениях из экспериментальных язв желудка у 15 животных (собаки) показали, что сразу после нанесения желпластана и лиофилизата новосэвен на опытную кровоточащую язвенную поверхность проявлялись их кровоостанавливающие свойства. Гемостатический эффект на экспериментальных кровоточащих язвах проявлялся сразу в течении 3-4 сек после их однократного нанесения. Последующая инсуффляция гранулированного сорбента диовина способствовала образованию в области язвы гелеобразного клеевого "матрикса" из окрашенного кровью гидрогеля, предохраняющего гемостатические средства и язвенный дефект от раздражающего действия желудочного содержимого и который, благодаря своим адгезивным свойствам, сохранялся на поверхности язв 3-4 суток. Под этим гидрогелевым слоем в опытных язвах происходили снятие воспалительных явлений, появление грануляций, краевая эпителизация, т.е. заживление дефекта. Таких двух пневмоинсуффляций было достаточно для полноценного заживления язвенных дефектов и восстановления эпителиального слоя.
Проведение динамических эндоскопических наблюдение позволило выявить, что окончательный гемостаз был достигнут во всех 15 язвах опытной группы, а в контроле окончательный гемостаз наблюдался лишь в 10 язвах. Повторных кровотечений или других каких-либо осложнений, связанных с комбинированным применением гемостатических средств и гранулированного сорбента при лечении моделированных язвенных кровотечений в опытных язвах не наблюдалось. В контрольных язвах было отмечено 5 эпизодов повторного кровотечения. В двух случаях наблюдалось появление тёмного сгустка крови на дефекте, в трёх случаях были выявлены точки гематина на дне язвенных дефектов. Эпизоды рецидива кровотечения в этих контрольных язвах прекращались самостоятельно. Оценки различий между группами по качественным признакам производили с использованием точного критерия Фишера (таблица 1).