Автореферат: Морфогенетическая активность дерморфина и его аналогов в различных клеточных популяциях

Примечание: * р<0,05

Рис. 3. Влияние обработки оплодотворенной икры различными концентрациями седатина на скорость выклева предличинок осетра амурского.

Максимальный эффект был зарегистрирован при использовании дозы пептида 0,01 и 0,1 мг/л. Увеличение концентрации седатина до 0,2 мг/л привело к уменьшению выраженности эффекта, что, возможно, является отражением «колоколообразной» зависимости «доза-эффект», характерной для РП.

Наряду с общими показателями количества сформировавшихся личинок, важным параметром является скорость выклева. Обеспечение «дружного» выклева является важной проблемой рыбоводства.

Воздействие седатина значительно увеличивало скорость выклева, особенно, в первые 24 часа (рис. 3).

Максимальная выживаемость мальков через 60 дней после обработки седатином имела место при воздействии пептидом 0,1 мг/л. Это позволило нам остановиться в последущих исследованиях на дозе 0,1 мг/л.

Наблюдение за общим состоянием, поведенческими реакциями, а также анализ соматометрических показателей мальков экспериментальных групп осуществляли в течение 2 месяцев (60 дней) с момента выклева до периода помещения особей в естественную среду обитания.

Однократное воздействие седатином в дозе 0,1 мг/л на оплодотворенную икру осетра амурского индуцировало увеличение массо-ростовых показателей подопытных особей по сравнению с контрольными параметрами (рис. 4).

Рис. 4. Влияние однократной обработки оплодотворенной икры осетра амурского раствором седатина на динамику соматометрических показателей мальков в постнатальном периоде (а - длина тела; б - масса тела; * р<0,05).

Результаты исследования сравнения эффектов безаргининового аналога седатина и седатина свидетельствуют в пользу ускоренного развития мальков, подвергнутых воздействию аргининсодержащего аналога дерморфина (табл. 9).

Таблица 9 Влияние обработки оплодотворенной икры синтетическими аналогами дерморфина (седатин и седатин без аргинина) в дозе 100 мкг/л на соматометрические показатели 60-суточных мальков осетра амурского

Примечание: * р<0,05

Таким образом, обработка икры осетровых раствором седатина не вызывает негативных отклонений в последующие 2 месяца развития рыб. Более того, по данным соматометрии, имеют место признаки ускоренного развития подопытных мальков. Полученные результаты, судя по стабильности индекса упитанности по Фултону, свидетельствуют в пользу гармоничности процесса роста и развития мальков. Изменение структуры молекулы пептида удаление аминокислотного остатка аргинина (эксперимент с безаргининовым аналогом седатина), приводит к нивелированию эффекта седатина в отношении соматометрических показателей.

Активность процессов свободнорадикального окисления определяли в образцах оплодотворенной икры через 18 часов после проведения инкубации с пептидами. Установлено, что при воздействии седатина на инкубируемую икру осетра амурского активируются системы антиоксидантной антирадикальной защиты: в сравнении с контролем величина S2_инд статистически значимо снизилась в 1,6 раза. Наблюдается увеличение перекисной резистентности (Н2 снизилась в 2,1 раза) и замедление процесса генерации перекисных радикалов (S1_инд снизилась в 1,5 раза).

Анализ показателей хемилюминесценции (табл. 10) гомогенатов сердца и печени 60-суточных мальков, подвергнутых в антенатальном периоде развития однократной обработке седатином, продемонстрировал, что воздействие пептида увеличило буферную емкость антиоксидантной и антирадикальной системы защиты, а также перекисную резистентность в исследуемых тканях. Об этом свидетельствуют статистически значимое снижение амплитуды H2 (в 1,26 и 1,36 раза) и величины S2_инд (в 1,31 и в 1,43 раза), соответственно. Выявленные изменения активности защитных систем не влияли на редокс-потенциал исследуемых тканей: величины S sp не имели достоверных отличий от контрольных уровней.

Таблица 10. Влияние однократной обработки оплодотворенной икры осетра амурского седатином на показатели хемилюминесценции (в отн. ед.) гомогенатов сердца и печени 60-суточных мальков

Примечание: * p<0.05

Представляет интерес тот факт, что изменения свободнорадикального статуса (повышение уровня антиоксидантной защиты), сохранились в тканях сердца и печени у 60-суточных мальков (таблица 10). Таким образом, действие седатина носит долгосрочный характер. Одним их возможных объяснений этому может быть эффект эмбрионального импринтинга, опосредуемого свободнорадикальными механизмами. Подобные изменения могут быть оценены как позитивные, поскольку способствуют повышению адаптируемости особей к негативным воздействиям внешней среды.

Анализ состояния ЯО осуществляли в ткани печени и миокарда сорокапятисуточных особей. Выбранный возраст определялся тем, что к этому времени у мальков полностью сформированы органы. С показателями контрольной группы сопоставляли показатели группы мальков, подвергнутых в зародышевом периоде воздействию седатина и его безаргининового аналога в концентрациях 0,1 мг/л. В наших исследованиях получены результаты, свидетельствующие о достоверном увеличении количества ЯО у подопытных особей группы «седатин», по сравнению с контрольными. Среднее число ядрышек в ядрах гепатоцитов в контрольной группе мальков составило 3,22 ± 0,15, в подопытной - 5,43 ± 0,30. У мальков, подвергнутых на ранних этапах развития воздействию «безаргининового» аналога седатина, изменения носили недостоверный характер. При анализе гистологических препаратов сердца подопытных особей молоди осетра амурского среднее число ядрышек в ядрах клеток миокарда в контрольной группе мальков составило 3,14±0,14. В подопытной группе количество ядрышек на ядро в среднем составило 5,03±0,29 (р<0,05).

Прямым доказательством воздействия седатина на белоксинтетическую активность были исследования по определению суммарного белка в поперечно-полосатых мышцах 60-суточных мальков. У рыб контрольной группы диаметр мышечных волокон составлял 22,28±0,71 мкм, а у подопытных он возрастал до 24,57±0,68 мкм, причем это увеличение было статистически значимым (р<0,05). Морфометрические измерения показали, что в мышцах контрольных рыб площадь ядер равнялась 57,38 ±1,48 мкм² . В мышцах подопытных рыб этот показатель возрастал до 60,50 ±2,33 мкм² , но это увеличение было статистически недостоверным. Средние величины числа ядрышек и ядрышко-ядерного отношения также статистически не отличались между собой, а вот суммарная площадь ядрышек, при обработке седатином, возрастала до 8,03±0,14 мкм² (табл. 11).

Таблица 11. Изменения морфометрических параметров мышечных волокон и ядерно-ядрышкового аппарата осетровых рыб под влиянием седатина (M ± m)

Примечание: * р<0,05

Компьютерная морфометрия показала, что у контрольных рыб оптическая плотность мышечных волокон при окраске амидо-черным 10В составляла 0,403±0,012. У подопытных рыб она возрастала до 0,514±0,012, Причем, это возрастание было статистически достоверным (p0,05).

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют, что под влиянием седатина у подопытных рыб, наряду с увеличением диаметра мышечных волокон и возрастанием ядрышковой активности, отмечается также увеличение концентрации суммарного белка в саркоплазме.

Вопрос о механизмах активации ЯО в различных клеточных популяциях у мальков, подвергнутых воздействию седатина, требует своего экспериментального решения. Тот факт, что эффект отсутствовал при обработке безаргининовым аналогом, свидетельствует в пользу рабочей гипотезы о нитроксидергическом механизме или компоненте в реализации эффектов седатина.

Подтверждением справедливости этого предположения служат данные литературы об активации оксидом азота факторов транскрипции. Как и в других исследовательских ситуациях, эффект NO на факторы транскрипции, зависит от дозы и ряда условий. Оксид азота может оказывать стимулирующий эффект на взаимодействие AP-I и молекулы ДНК - этот эффект опосредуется через активацию Jun-terminal Kinise (Van der Zwan L.P., et al. Kim H. et al., 2010). Кроме того, продемонстрирована возможность активации, посредством NO и его метаболитов, другого важного транскрипционного фактора - NF-кB. Полученные нами свидетельства вовлеченности нитроксидергических механизмов в реализацию адаптивных свойств седатина, находят подтверждение в опытах (Chadzinska M. et al., 2009). Отсутствие в наших исследованиях положительного эффекта у безаргининового аналога седатина еще раз подтверждает обоснованность предположения о вовлеченности нитроксидергического компонента в оптимизацию процессов развития рыб. В связи с этим представляют интерес данные Cadet P. et al. (2007) о важной роли оксида азота в становлении и функционировании кардиоваскулярной системы на разных этапах онтогенеза. Применительно к личинкам и молоди рыб этот вопрос обсуждается в работах F.B. Eddy, (2005). При этом также как в исследованиях Chadzinska M. et al. (2009), оценивается роль NO, как стрессмодулятора молоди рыб. Важно отметить, установленное в наших исследованиях повышение активности антиоксидантной антирадикальной защиты. Эта перестройка является необходимым фактором адекватного функционирования оксида азота. Способность седатина активировать антиоксидантную и антирадикальную защиту во многом объясняет ускорение выклева предличинок под влиянием пептидов. Сохранение в ткани сердца и печени 60-дневных мальков позитивных сдвигов в обмене активных кислородных метаболитов находит частичное объяснение в данных Chadzinska M. еt al. (2009) о способности агонистов мю-рецепторов модулировать экспрессию генов цитокинов. Перестройка активности экспрессии генов на ранних этапах онтогенеза может быть еще одним фактором, обеспечивающим долгосрочные эффекты опиоидов. Особо следует выделить такой эффект воздействия седатина, как увеличение массы мальков на ранних стадиях развития.

Увеличение соматометрических показателей под влиянием седатина является важным критерием более высоких адаптационных способностей. Рыбы одного возраста, но меньшего размера (массы), выживают в меньшем количестве (Бойко Н.Е., 2008). Выживаемость молоди зависит от ее массы и это лежит в основе весовых стандартов при выпуске мальков. Начальное отставание в массе сохраняется в последующие периоды, независимо от условий выращивания (Бойко Н.Е., 2008).

Результаты исследования влияния седатина на выклев, рост и развитие молоди осетровых рыб, а также на ряд морфометрических показателей сердца, печени и мышц, легли в основу нового способа оптимизации развития рыб осетровых пород (Флейшман М.Ю., Тимошин С.С. и соавт., патент РФ № 2298921 от 20.05.2007). Этот метод используется на ряде рыборазводных предприятий Дальнего Востока.

При анализе возможных внутриклеточных путей реализации митогенных эффектов опиоидов мы рассматривали: во-первых, активацию экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста; и, во-вторых, G_вг PI3K-Akt каскада. Кроме того, активно изучается третий путь, связанный с модуляцией активности NO (Tegeder I., Geisslinger G., 2004).

Ряд лигандов субпопуляций опиоидных рецепторов, через мю-3 рецепторы, могут индуцировать образование NO посредством активации системы G_вг -PI3K- Akt. Akt способна стимулировать эндотелиальную NOS (Dimmeler S. et al., 1999; Fulton D. et al., 1999). В иммуноцитах морфин может индуцировать образование NO также посредством взаимодействия и активации мю-3 рецепторов (Fimiani C. et al., 1999, b).

Процессы активации ангиогенеза и вазодилятации, индуцируемые морфином, связывают с активацией мю-3 рецепторов (Bilfinger T.V. et al., 1998; Gupta K. et al., 2002). Мю-3 рецепторы представялют из себя сплайсинговый вариант, продуцируемый геном мю-опиатных рецепторов (Cadet P. et al., 2003). Экспрессия мю-3 рецепторов продемонстрирована в легочной ткани, при этом их активация приводит к освобождению NO (Fimiani C. et al., 1999). Способность морфина индуцировать образование NO в лейкоцитах, отменяемое L-NAME, показана в исследованиях (Mantione K.J. et al., 2008). Важную роль играют мю-3 опиатные рецепторы, регулирующие образование NO, что имеет место в процессах эмбриогенеза (Cadet P. et al., 2007). Согласно данным этих авторов, мю-3 рецептор экспрессируется на ранних стадиях развития раньше, чем, традиционные мю-1, дельта- и каппа- рецепторы. Это может служить одним из объяснений столь эффективному воздействию седатина на развитие молоди рыб при обработке им оплодотворенной икры. Однако следует иметь ввиду, что мю-3 рецепторы взаимодействуют с непептидными лигандами. При этом возможность взаимодействия седатина с мю-3 рецепторами в настоящее время обсуждается. В задачи нашего исследования не входило решение вопроса о том, с какой субпопуляцией опиатных рецепторов взаимодействует седатин. Эта характеристика пептида определяется другими методическими подходами и требует экспериментального решения. У нас нет прямых доказательств опосредованности этого эффекта через мю-3 рецепторы. При этом следует иметь в виду, что система NOS-NO может запускаться различными механизмами, а не только аргинином или активацией мю-3 рецепторов. Так, было установлено, что активация NOS-NO в СОЖ может осуществляться посредством глипролина (Pro-Gly-Pro), являющегося составной частью опиоидного пептида бета-казоморфина (Samonina G.E. et al., 2008; Мартынова К.В. и соавт., 2009).