Морфогенетическая активность дерморфина и его аналогов в различных клеточных популяциях
03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
ФЛЕЙШМАН Марина Юрьевна
Владивосток, 2010
Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет Росздрава»
Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Тимошин Сергей Серафимович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Склянов Юрий Иванович ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава» доктор биологических наук Вараксин Анатолий Алексеевич ГУ Институт биологии моря, г. Владивосток доктор медицинских наук, профессор Елисеева Екатерина Валерьевна ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Росздрава»
Ведущая организация: ГУ НИИ морфологии человека РАМН (г. Москва)
Защита диссертации состоится 22 октября 2010 года в «___» часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Росздрава» (690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2
Автореферат разослан «___»______________2010 года.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Г.В. Рева
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Регуляторные пептиды филогенетически самая древняя форма управления. Они обнаружены у прокариот и выявлены, фактически, во всех тканях млекопитающих. Это дало основание для положения, что, «все органы и ткани животных являются эндокринными и секретируют гормоны пептидной природы» (Панков Ю. А., 1996; 2005).
Семейство опиоидных пептидов наиболее многочисленное и самое изученное из представителей регуляторных пептидов (Зайцев С. В. и соавт. 1993; Ашмарин И. П., 2005). Выделение эндогенных опиоидных пептидов изменило представление о функционировании регуляторных систем. Рецепторы опиоидных пептидов были идентифицированы в нейронах, в клетках иммунной и эндокринной систем, в клетках ЖКТ и др. Способность клеток интегративной системы секретировать различные регуляторные пептиды, а также наличие на них рецепторов к этим пептидам обеспечивает «закольцованность» интегративных систем в единый регуляторный континуум (Koroleva S. V., Ashmarin I. P., 2002, 2006).
Высокая физиологическая активность РП послужила толчком для создания на основе их химических аналогов фармакологических препаратов. Список подобных лекарств исчисляется сотнями (Oliver K.R. et al., 2000; Brain S.D., Cox H.M., 2006; Delgado M., Ganea D., 2008). Это в полной мере относится к опиоидным пептидам.
Дерморфины - особый класс семейства опиоидных пептидов. У всех природных дерморфинов присутствует N-концевая последовательность Tyr-D-Ala-Phe, в которой между двумя ароматическими кольцами Tyr и Phe расположен D-аминокислотный остаток аланина, что обусловливает специфику биологической активности дерморфинов. Устойчивость дерморфина к действию эндогенных пептидаз, а также уникальная анальгетическая активность, превышающая этот показатель у морфина на два порядка, послужили предпосылкой для создания синтетических аналогов дерморфина.
Изучение биологической активности пептидов выявило их адаптогенные свойства, способность влиять на терморегуляцию, сон и оказывать антиалкогольное воздействие (Громова Е.А. и соавт., 1989; Ярова Е.П., 1990; Ковальзон В.М. и соавт., 2002; Емельянова Т.Г. и соавт., 2007; Reddy P. A. et al., 2009). В наших предыдущих исследованиях было установлено, что дерморфин и его аналоги вовлечены в регуляцию процессов клеточного деления.
Одна из тенденций современных фундаментальных исследований в биологии направлена на получение предпосылок к созданию на основе исследуемых эндогенных регуляторов фармакологических препаратов. В настоящее время на базе одного из аналогов дерморфина - седатина (H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH), создается лекарственная форма. Препарат является официнальным в ветеринарии и готовится к клиническим испытаниям. Поэтому всестороннее изучение его влияния на различные цитофизиологические процессы имеет прикладное значение.
На момент начала настоящей работы оставались неизученными такие важные аспекты влияния дерморфинов, как участие в поддержании тканевого гомеостаза в условиях патологии, в частности, при НПВП-гастропатии. Неизвестны механизмы, посредством которых дерморфины реализуют свое цитопротективное действие в этих условиях. Ранее нами было изучено влияние дерморфинов на процессы пролиферации у крыс.
Вопрос о способности влияния представителей этого семейства опиатов на процессы регенерации у других представителей типа хордовых, в частности, у рыб, отсутствует. Не исследовалось влияние дерморфинов на ранние этапы онтогенеза и возможные долгосрочные эффекты аналогов дермофина.
Отсутствовали сведения о вовлеченности дерморфина и его аналогов в регуляцию процессов свободнорадикального окисления. В последние годы имеет место переосмысливание представлений о свободнорадикальном окислении, как важном факторе патогенеза и регуляции, в том числе, процессов клеточного деления.
Цель настоящего исследования:
Изучить влияние дерморфина и его аналогов на состояние тканевого гомеостаза в различных клеточных популяциях.
Задачи исследования: дерморфин седатин роговица
1. Изучить характер влияния дерморфина и его аналогов, обладающих различным сродством к мю- и дельта- рецепторам, на процессы синтеза ДНК в различных клеточных популяциях.
2. Изучить характер влияния дерморфина и его аналогов на процессы синтеза ДНК при непосредственном воздействии (аппликации на роговицу и введении в культуру дермальных фибробластов).
3. Изучить характер влияния различных доз аргининсодержащего аналога дерморфина - седатина на процессы синтеза ДНК в эпителии слизистой оболочки желудка и роговицы белых крыс.
4. Изучить характер влияния аналогов дерморфина на процессы синтеза ДНК в СОЖ при НПВП-гастропатии.
5. Изучить механизмы цитопротективного действия седатина при НПВП-гастропатии.
6. Изучить характер влияния аналогов дерморфина на процессы морфогенеза осетровых рыб и оценить возможность отдаленных эффектов при обработке оплодотворенной икры пептидами.
7. Изучить возможность использования аналогов дерморфина для оптимизации процессов разведения осетровых рыб.
Научная новизна:
Впервые установлена способность седатина стимулировать процессы синтеза ДНК в эпителии желудка в широком диапазоне доз.
Впервые установлена способность седатина осуществлять протективный эффект при нарушении целостности СОЖ, индуцированном производными ацетилсалициловой кислоты.
Впервые установлено участие системы Arg-NOS в протективном эффекте седатина при НПВП-гастропатии.
Впервые установлено, что обработка оплодотворенной икры осетровых рыб седатином оптимизирует процессы развития осетровых рыб.
Впервые разработан метод использования седатина для оптимизации процессов разведения осетровых рыб.
Практическая значимость:
1. Установленная нами способность седатина - потенциального фармакологического препарата - оказывать цитопротективные эффекты при НПВП-гастропатии, может быть использована в клинической практике для профилактики нарушений целостности СОЖ при приеме нестероидных противовоспалительных препаратов.
2. Разработанный нами метод оптимизации разведения осетровых рыб используется на рыборазводных предприятиях Дальнего Востока.
3. Обнаруженные нами закономерности влияния аналогов дерморфина на процессы синтеза ДНК в норме и при патологии могут быть использованы при планировании направленного синтеза пептидов, обладающих цитопротективным действием.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Седатин уменьшает язвенно-эрозивные поражения, индуцированные в желудке нестероидными противовоспалительными препаратами.
2. В реализации морфогенетических эффектов седатина важная роль принадлежит его способности ослаблять проявления окислительного стресса.
3. Обработка икры осетровых рыб седатином оптимизирует процессы развития молоди.
Публикации:
По материалам диссертации опубликовано 32 научных работ (из них 16 - в изданиях рекомендуемых Высшей Аттестационной Комиссией), 2 патента РФ, 4 статьи в международных журналах; 3 - тезисы докладов на конференциях с международным участием.
Апробация работы:
Основные положения диссертации представлены на 2-ом съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995); на научно-практической конференции с международным участием «Проблемы фармакологии и фармации на Дальнем Востоке» (Хабаровск, 1997); на научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные и клинические аспекты охраны здоровья детского и взрослого населения Дальневосточного региона» (Хабаровск, 2003); на научно-практической конференции «Актуальные проблемы гастроэнтерологии» (Хабаровск, 2010).
Внедрение результатов:
Полученные данные о характере влияния регуляторных пептидов (синтетических аналогов дерморфина) на состояние тканевого гомеостаза внедрены в курс лекций на кафедре нормальной физиологии ДВГМУ. Использование седатина по запатентованной нами схеме применяется на рыборазводных предприятиях Крайрыбакколхозсоюза, а также на Владимировском, Анюйском и Новоамурском предприятиях.
Объем и структура диссертации:
Диссертация состоит из оглавления, списка сокращений, введения, 6 основных глав, выводов и списка литературы, включающего ссылки на публикации 152 отечественных и 331 иностранных авторов. Объем диссертации составляет 201 страницы машинописного текста и включает 24 таблицы и 27 рисунков.
Содержание работы
Характеристика исследуемых веществ
Изучали влияние дерморфина и его аналогов на морфогенетические процессы у млекопитающих и рыб. Cинтез пептидов осуществлялся в лаборатории химии пептидов (Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН) профессором, д.м.н. В.И. Дейгиным и к.б.н. Е.П. Яровой. В настоящей работе исследовали дерморфин и пептиды, получившие условные названия в лаборатории и имевшие следующие структурные формулы:
«дерморфин» - Н-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2
«A-10» - H-Tyr-D-Orn-Phe-Gly-OH
«A-43» - H-Arg-Tyr-D-Arg-Phe-D-Ala-NH2
«A-17» - H-Arg-Tyr-D-Lys-Phe-Gly-OH
«седатин» - H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH
«седатин без аргинина» - H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH
Пептиды синтезировались с применением классического и твердофазного методов синтеза. Очистка и контроль производилась с помощью ВЭЖХ (высо коэф фективной обращеннофазовой жидкостной хроматографии) и тонкослойной хроматографии, в условиях, индивидуально подобранных для каждого аналога. Содержание пептидов в сухом веществе составляло не менее 97,5%. Вещества идентифицированы данными метода 1Н-ЯМР спектро скопии высокого разрешения (500 МГц.). Мы благодарим д.м.н., проф. В.И. Дейгина за предоставленные вещества.
По результатам биологического тестирования А10 и А43 относятся, в основном, к классу м- агонистов (тест GPI). А17 и седатин проявляют подобные свойства в отношении м- рецепторов, но, по сравнению с А10 и А43, активно взаимодействуют с д- рецепторами (тест MVD).
В экспериментах, где применялся ингибиторный анализ, использовались вещества L-NAME и налоксон:
«L-NAME» - метиловый эфир NG-нитро-L-аргинина («ICN Biomedicals Inc.», USA) - неселективный ингибитор cNOS использовался в дозе 9,3х10-5 моль/кг (Boer R. et al., 2000).
«Налоксон» - налоксон-гидрохлорид (“Endo Lab.”, USA) - блокатор опиоидных рецепторов, использовался в дозе 5,5х10-4 моль/кг.
Экспериментальные животные, объекты и методы исследования
Опыты проводили на белых крысах-самцах массой 160-210 г., и самцах белых мышей массой 25 - 30 г. Содержание животных и проведение экспериментов осуществлялось в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными Приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. Экспериментальные группы формировали из 8-12 животных, достоверно не различающихся между собой по показателю массы.
Животных содержали при температуре 18-20оС, естественном световом режиме и свободном доступе к воде и пище. Всего в работе использовано 1123 животных. Дерморфин и его аналоги исследовали в дозах 0,1 мкг/кг-1 мг/кг. В основной группе исследований пептид вводился в дозе 10-100 мкг/кг. Вещества вводили внутрибрюшинно с 11 до 12 часов дня. Контролем служили интактные животные, а также животные, подвергнутые инъекции эквиобъемного количества (0,1 мл на 100 г. массы тела) стерильного изотонического раствора хлорида натрия в соответствующем режиме.
Объектом исследования служили эпителиальные ткани лабораторных мышей и крыс. Изучали влияние пептидов на синтез ДНК в эпителии роговицы и слизистой оболочке фундального отдела желудка.