Автореферат: Морфогенетическая активность дерморфина и его аналогов в различных клеточных популяциях

Примечание: * р< 0,05

Индекс меченых ядер увеличивался в 1,42 - 2,02 раза. Дозы 0,1 мкг/кг и 1 мкг/кг приблизительно соответствуют 1,310^-10 М/кг и 1,310^-9 М/кг, что вполне сопоставимо со сверхнизкими дозами иммуноактивных пептидов, стимулировавших пролиферативные процессы в исследованиях Григорьева Е.И. и соавт. (2003).

Определенный вклад в стимуляцию пролиферативных процессов в СОЖ под влиянием седатина осуществляется за счет способности пептида оптимизировать процессы СРО в тканях желудка (табл. 4).

Таблица 4. Влияние введения седатина и безаргининового аналога седатина на показатели хемилюминесценции (в отн. ед.) гомогенатов желудка самцов белых крыс (Mm)

Примечание: * p<0,05

Седатин проявил выраженные антиоксидантные антирадикальные свойства, о чем свидетельствует уменьшение значений S2_инд , Н2 в 1,7 и 1,2 раза, соответственно. Это способствовало угнетению продукции свободных радикалов в целом (S_сп сократилась в 1,8 раза). Кроме того, наблюдалось снижение уровня гидроперикисей липидов (Н1) в 1,5 раза и торможение процессов образования и накопления перекисных радикалов (S1_инд) в 1,5 раза. Введение безаргининового аналога седатина сопровождалось лишь снижением скорости образования свободных радикалов (S1_инд снизилась в 1,3 раза).

Мы считаем, что наличие аргинина в синтетических аналогах опиоидных пептидов не определяет многообразия их биологических эффектов. Однако присоединение аргинина к лиганду опиоидных рецепторов приводит к модификации их морфогенетической активности.

Не универсальный митогенный эффект седатина в различных клеточных популяциях, сочетающийся с его способностью стимулировать синтез ДНК в эпителии СОЖ в широком диапазоне доз, опосредованность этого эффекта через активацию синтеза NO и ослабление проявления оксидативного стресса послужили предпосылками для применения пептида в целях профилактики НПВП-гастропатий.

Влияние дерморфина и его аналогов на индуцируемое индометацином повреждение слизистой оболочки желудка НПВП-гастропатии у мышей моделировали посредством внутрижелудочного введения индометацина по описанной ранее методике. Средняя площадь язвенно-эрозивного поражения у животных, получавших индометацин без предварительного воздействия пептидов, составила 8,12±0,91 мм². Введение дерморфина недостоверно снизило площадь повреждения СОЖ (7,10±1,10 мм²); пептид А10 утяжелил картину поражения слизистой (9,21±1,24 мм²), но различия также носили недостоверный характер. Результаты исследования состояния СОЖ у животных, получавших индометацин на фоне пятикратного введения седатина, свидетельствуют о протективном действии препарата в этих условиях (рис. 2). Об этом можно судить по уменьшению площади язвенно-эрозивных дефектов: в то время, как у животных, получавших индометацин, средняя площадь повреждения СОЖ составила 7,43±1,0 мм², площадь язвенно-эрозивных дефектов СОЖ у мышей, получавших индометацин на фоне пятикратного введения седатина, уменьшилась до 4,24±1,12 мм² , то есть, поражение СОЖ уменьшилось в 1,75 раз.

Рис. 2: Влияние дерморфина и его аналогов на площади эрозивно-язвенного повреждения слизистой оболочки желудка белых мышей, индуцируемые индометацином.

Примечание: * достоверное отличие от группы «индометацин» (р<0,05)

Одной из причин изъязвления СОЖ при воздействии НПВП считается угнетение процессов синтеза ДНК. В наших исследованиях наблюдалось достоверное уменьшение ИМЯ. В то время как показатель ИМЯ в контрольной группе составил 9,60 ± 0,34; у животных, получавших индометацин, ИМЯ уменьшился до 5,28 ± 0,20, то есть, в 1,8 раз (табл. 5). Другим важным показателем нарушения процессов пролиферации под воздействием индометацина является уменьшение ИМ, косвенно свидетельствующее об уменьшении скорости синтеза ДНК: в контроле ИМ составила 19,16 ± 0,70; под воздействием индометацина ИМ уменьшилась в 1,7 раз и составила 11,16 ± 0,90. Сочетание уменьшения количества ДНК синтезирующих клеток с уменьшением скорости прохождения клетками S-периода свидетельствует о выраженном нарушении процессов пролиферации.

Таблица 5. Влияние седатина и его безаргининового аналога на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка белых мышей, получавших индометацин (Mm).

Примечание: * р<0,05

Одним из механизмов протективного действия седатина при НПВП-гастропатиях, на наш взгляд, является его способность стимулировать пролиферативные процессы. Хотя ИМЯ в группе животных, получавших индометацин на фоне пятикратного введения седатина, оставался на уровне 7,92+0,44 (достоверно ниже показателя ИМЯ в группе интактного контроля), он достоверно - в 1,5 раза (р<0,05), превышал значение ИМЯ у животных из группы, получавшей только индометацин. Безаргининовый аналог седатина не оказал достоверного цитопротективного эффекта. Об этом свидетельствует отсутствие различий в величинах ИМЯ в СОЖ у животных в группах «индометацин» и «безаргининовый аналог седатина + индометацин».

Результаты ХМЛ анализа гомогенатов желудка животных, получавших НПВП, свидетельствуют о формировании выраженного оксидативного стресса. Все исследуемые показатели, характеризующие СРО, увеличивались, по сравнению с интактным контролем, в 2,7 - 4,8 раза (табл. 6).

Таблица 6. Влияние седатина и его безаргининового аналога на показатели хемиюминесценции (в отн. ед.) гомогенатов желудка белых мышей, получавших индометацин (Mm)

Примечание: * p<0,05

Полученные нами результаты соответствуют литературным данным о свободнорадикальных механизмах гастротоксичности нестероидных противовоспалительных препаратов (Евсеев М. А., 2007). Предварительное воздействие седатина вызывает коррекцию прооксидантно-антиоксидантного статуса тканей желудка у животных, получавших индометацин (табл. 6). Хотя ни один из исследуемых ХМЛ-показателей не достиг контрольного уровня, все они значительно приблизились к нему, достоверно изменившись в сравнении с показателями группы животных, получавших индометацин без коррекции - пятикратного введения седатина. Интенсивность СРО снижалась и за счет угнетения первичного этапа пероксидации липидов и замедления образования перекисных радикалов. Об этом свидетельствует уменьшение амплитуды Н1 - в 1,3 раза и величины S1 _инд.. - в 1,9 раза, при сравнении показателей групп «индометацин» и «седатин + индометацин» (табл. 6). Подтверждением роли фланкирующего аргинина в реализации биологических эффектов седатина были результаты ХМЛ анализа (оценка действия седатина и безаргининового аналога седатина). Отсутствие в пептиде молекулы аргинина привело к потере антирадикальных свойств. Защитный эффект седатина при индометациновом повреждении СОЖ мог быть обусловлен селективной коррекцией нарушений в системе L-arginine-NOS-NO, играющей важную роль в формировании прооксидантно-антиоксидантного равновесия (Jones D.P., 2008).

Важным свойством седатина в реализации протективного действия по отношению к СОЖ, является сочетание в нем способности ослаблять выраженность оксидативного стресса и индуцировать образование NO. При оксидативном стрессе из NO образуется токсичный пероксинитрит (ONOO-), который, индуцирует процессы апоптоза и некроза. При нормализации прооксидантно-антиоксидантного равновесия NO осуществляет свои цитофизиологические эффекты, в частности, нормализует микроциркуляцию и стимулирует пролиферативные процессы в СОЖ (Ahmad R. et al., 2009).

Доказательством участия системы L-аrginine-NOS-NO в адаптации СОЖ являются результаты опытов с введением ингибитора NOS L-NAME. В то время, как у интактных животных ИМЯ в эпителии СОЖ составил 4,10±0,83, у животных, получавших L-NAME+ индометацин, он составил 2,33±1,60. Введение L-NAME животным, получавшим, наряду с индометацином, седатин, нивелировало цитопротективный эффект седатина. ИМЯ в СОЖ у животных, получавших «L-NAME+седатин+индометацин», был 2,92±0,61, достоверно не отличался от соответствующего показателя группы «L-NAME+ индометацин», и в обоих случаях величина ИМЯ была достоверно ниже величины ИМЯ интактного контроля. Полученные нами результаты, в определенной степени, подтверждают выводы наших предыдущих исследований о важной роли молекулы аргинина в реализации морфогенетических и антиоксидантных свойств седатина (Флейшман М.Ю. и соавт., 2007). Одним из возможных механизмов, через которые седатин опосредует свои защитные эффекты, является изменение концентрации гистамина в СОЖ (табл. 7).

В наших опытах, на фоне индуцируемых НПВП язв и эрозий, имело место более чем двукратное падение концентрации гистамина в тканях желудка. Это свидетельствует в пользу гипотезы о том, что дефицит гистамина является одним из факторов нарушения целостности СОЖ. Способность седатина нормализовать содержание гистамина помогает выявить еще один механизм его цитопротективного действия. Тот факт, что способностью нормализовать концентрацию гистамина, наряду с седатином, обладал его безаргининовый аналог, выводит полученные результаты из общей закономерности, согласно которой cедатин проявляет цитопротективные свойства только при наличии в структуре аргинина.

Таблица 7. Влияние пятикратного введения аналогов дерморфина в дозе 100 мкг/кг на концентрацию гистамна в ткани желудка белых мышей (M ± m)

Примечание: * р< 0,05

Результаты наших исследований о вовлеченности гистамина в процессы адаптации СОЖ к повреждающему действию НПВП, сопоставленные с данными литературы, могут служить в пользу представления об участии гистамина в профилактике и заживлении язв и эрозий в этих условиях. Следует отметить, что эти предположения требуют дальнейшего экспериментального исследования.

В желудках грызунов гистамин депонируется в тучных и ECL (энтерохромафинподобных) клетках. Гистамин через Н1 и Н3 рецепторы может оказывать выраженные морфогенетические эффекты. В частности, гипергастринемия, которая стимулирует пролиферативные процессы в СОЖ, реализует эти эффекты через гистамин ECL клеток (Nakamura E. et al., 2004). Согласно представлениям Parsons M. E. (1985), Hernбndez-Angeles A. et al. (2001), Deyama Y. et al. (2002), гистамин является локальным митогеном. Процессы адаптации СОЖ к повторным воздействиям иммобилизационного стресса сопровождаются увеличением содержания гистамина в тканях желудка (Тимошин С. С. и соавт., 1991).

Влияние дерморфина на ранние периоды развития рыб осетровых пород

Одним из облигатных условий апробации потенциальных фармакологических препаратов является подтверждение их эффектов и отсутствие токсических проявлений на нескольких видах животных объектов. Опиоидные пептиды присутствуют у рыб на эмбриональных, «донервных» стадиях развития (Яковлева Т.В. и соавт., 1986), а также в тканях развивающихся и взрослых особей (Папин А.А., Карелин А.А., 1984; Singh R., Rai U., 2009; Macho Sanchez-Simon F., Rodriguez R.E., 2009). Исследования проводились на икре и молоди осетра амурского (Acipenser schrenckii) на протяжении четырех рыборазводных сезонов. Инкубация оплодотворенной икры осетра амурского с раствором седатина (0,001-0,2 мг/л) в течение 1 часа приводила к увеличению процента выклева. Эффект зависел от использованной концентрации пептида (табл. 8).

Таблица 8. Влияние обработки оплодотворенной икры различными дозами седатина на динамику выклева личинок осетра амурского