Автореферат: Морфогенетическая активность дерморфина и его аналогов в различных клеточных популяциях

Кроме внутрибрюшинного введения дерморфина и его аналогов лабораторным мышам и крысам, исследовалась аппликация пептидов на роговицу и инкубация культуры фибробластов. В экспериментах с осетровыми породами рыб осуществлялась водная аппликация веществ (Лаптев В.И., 1981). В ряде экспериментов исследовали свойства пептидов в отношении заживления язв ЖКТ. На фоне пятидневного введения пептида в дозе 100 мкг/кг животные через желудочный зонд получали раствор нестероидных противовоспалительных препаратов (индометацина) в дозе 250 мг/кг, что вызывало повреждения СОЖ. Использовались зонды оригинальной конструкции (двух размеров - для мышей и крыс).

Морфометрическую оценку действия пептида осуществляли путем вычисления суммарной площади язв слизистой оболочки желудка. Использовали компьютерную морфометрическую приставку «МЕКОС-Ц»

Эвтаназию осуществляли посредством быстрой декапитации предварительно оглушенных крыс через 4 и 24 часа после заключительной инъекции пептида.

При оценке влияния аналогов дерморфина на развитие осетра амурского Acipenser schrenckii исследования проводили на икре и молоди. Получение половых продуктов и выращивание мальков амурского осетра осуществлялось в производственно-экспериментальных цехах рыболовецких колхозов «Новоамурский», Анюйский РЗ, Владимировский РЗ. Инкубацию осетровых осуществляли в стадии набухания оплодотворенной икры. Контрольные и подопытные образцы икры получены от одной самки для минимизации генетических различий. Каждая экспериментальная и контрольная группы включали около 30000 икринок. После вылупливания предличинок поштучно пересаживали по 2500 особей в бассейны на подращивание. Наблюдение за общим состоянием, поведенческими реакциями, а также анализ соматометрических показателей молоди осетра осуществляли в течение 2 месяцев (60 дней) - с момента выклева до периода помещения особей в естественную среду обитания. Массо-ростовые показатели, индекс упитанности по Фултону определяли на 22, 38, 60 сутки.

Процессы синтеза ДНК оценивали с помощью авторадиографии с ³Н-тимидином. Тимидин вводили в дозе 0,6 мкКu/г массы тела крысам и 1 мкКu/г массы тела мышам. Радиоавтографы изготавливали по принятой в лаборатории методике. Использовали фотоэмульсию двух видов: производства НИИХИМФОТО и KODAK Autoradigraphy Emulsion, (Type NTB, for Light Microscope Autoradiography). Индекс меченых ядер (ИМЯ) определяли на основании просмотра 2,5-3 тысяч клеток и выражали в процентах. Интенсивность метки (ИМ) подсчитывали как среднее количество зерен серебра над 50 мечеными клетками.

Определение морфометрических показателей ядрышек и ядра проводили, основываясь на работах Мамаева Н.Н. и соавт. (1989) и Цыганкова В.И. и соавт. (2004, 2006). Под притертые стекла, покрывающие депарафинированные и гидратированные срезы, вводили гель из смеси 1 части желатины, приготовленной на 1% растворе муравьиной кислоты и 2 частей 50% раствора азотнокислого серебра. Стекла выдерживали в термостате при 37^o С 10-15 минут. Морфометрию ядрышек и ядер проводили на анализаторе изображения «МЕКОС-Ц», окуляр 7х, объектив 60х. Для определения содержания общего белка в мышцах рыб в препаратах, окрашенных амидочерным 10В, оценивали оптическую плотность мышечных волокон, служившую показателем концентрации суммарного белка. Измерения не менее 50 мышечных клеток каждой особи проводили на анализаторе изображения «МЕКОС-Ц». Проводили морфометрию средней и интегральной оптической плотности миоцитов, их площади и периметра.

Для интегральной оценки процессов свободнорадикального окисления гомогенатов тканей желудка и сыворотки крови использовали метод хемилюминесценции. Регистрацию ХЛ осуществляли на люминесцентном спектрометре LS 50B «PERKIN ELMER». Спонтанную и индуцированную Fe²⁺ ХЛ исследовали по методу Владимирова Ю.А. (1991) и Арутюнян А.В. (2000). Определяли: светосумму за 1 мин. спонтанной ХЛ (S_сп.), величина которой коррелирует с интенсивностью генерации свободных радикалов; максимум быстрой вспышки (H₁) индуцированной ХЛ, свидетельствующий о содержании гидроперекисей липидов, светосумму (S_инд.1) за 2 мин. после "быстрой" вспышки, отражающую скорость накопления перекисных радикалов липидной природы. Кинетику ХЛ, инициированную H₂O₂ в присутствии люминола анализировали по двум параметрам (Арутюнян А.В. и соавт., 2000): максимуму свечения (H₂), указывающему на потенциальную способность биологического объекта к перекисному окислению, и светосумме за 2 мин. ХМЛ (S_инд.2), величина которой свидетельствует об активности антиоксидантной антирадикальной защиты. Интенсивность ХЛ, измеренную в милливольтах, рассчитывали на 1 г влажной ткани или в 1 мл сыворотки, выражали в относительных единицах.

Определение содержания гистамина в ткани желудка белых мышей проводили флюориметрическим методом (Сидельников Ю.Н., Сиворакша Г.А., 1994).

Исследования процессов пролиферации в культуре дермальных фибробластов белых крыс проводились на первичной культуре по методике, описанной Д.С. Саркисовым и соавт. (1995). Обработка регуляторными пептидами проводилась путем добавления раствора пептида в культуральную среду в концентрации 100 мкг/мл с последующей инкубацией в течение 3 часов. Затем, для приготовления радиоавтографов, клеточные монослои помещали в раствор ³Н-тимидина (1 мкКu/мл) на 1 час. После отмывки монослоев в растворе Хэнкса и фиксации в 96% этаноле производили приготовление радиоавтографов по принятой в лаборатории методике.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием компьютерной программы «Statistica 5.5». Данные подопытных и контрольных групп подвергали статистической обработке с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05 (Рокицкий П.Ф., 1961; Сепетлиев Д.А., 1968; Боровиков В.П., 1998).

Результаты исследования и их обсуждение

Собственные исследования подразделяются на три части:

1. Влияние дерморфина и его аналогов на процессы синтеза ДНК в различных клеточных популяциях;

2. Влияние дерморфина и его аналогов на индуцируемое индометацином повреждение слизистой оболочки желудка;

3. Влияние аналогов дерморфина на ранние периоды развития рыб осетровых пород.

Влияние дерморфина и его аналогов на процессы синтеза ДНК в различных клеточных популяциях

При однократом введении селективных мю-агонистов - дерморфина, А10 и А43 в дозе 10 мкг/кг имело место достоверное уменьшение ИМЯ в роговице через 4 и 24 часа после инъекции в 1,8 - 2,0 раза. Мю-дельта- агонисты седатин и А17 в этой дозировке не оказывали влияния на синтез ДНК в эпителии роговицы. Введение А10, А43, седатина и А17 привело к достоверному увеличению ИМЯ в эпителии фундального отдела желудка через 24 часа после введения пептидов. Аналогичная картина имела место при пятикратном введении пептидов в дозе 100 мкг/кг; при этом, мю-дельта-агонист седатин вызывал почти двукратное увеличение ИМЯ в эпителии роговицы. В эпителии желудка введение всех трех мю-агонистов (дерморфина, А10, А43) и введение мю-дельта-агонистов (седатина и А17) активировало синтез ДНК ( ИМЯ увеличивался в 1,4 - 1,5 раза). Это совпадает с данными литературы о том, что в тканях, где широко представлены мю-рецепторы, опосредующие аналгетический эффект, при введении лигандов этих рецепторов имеет место торможение процессов пролиферации (Радивоз М.И. и соавт., 1991; Тимошин С.С. и соавт., 1993). В энтодермальном эпителии желудка, где главным образом представлены дельта-рецепторы, мю-агонисты, взаимодействуя с ними, стимулируют пролиферативные процессы (Тимошин С.С. и соавт., 1993).

Другим существенным положением, основанным на данных этой группы экспериментов, было свойство остатка молекулы аргинина модифицировать способность опиатных пептидов оказывать влияние на пролиферативные процессы (рис. 1).

Рисунок 1. Влияние мю-агонистов опиатных рецепторов на

Рис. 1. Процессы синтеза ДНК в эпителии роговицы через 4 часа после введения пептидов и желудка - через 24 часа после введения пептидов.

Примечание: * р<0,05 по отношению к контролю.

* * р<0,05 различия достоверны между подопытными группами.

Синтетические аналоги дерморфина А10 и А43 являются селективными мю-агонистами (Ярова Е.П., 1987), при этом в структуре А43 аргинин присутствует в С-концевом положении. Присутствие аргинина в молекуле аналога дерморфина привело к достоверно меньшей депрессии ИМЯ в эпителии роговицы и к более выраженной стимуляции в эпителии желудка по сравнению с «безаргининовым» А10.

Доказательством зависимости митогенного эффекта аналогов дерморфина от присутствия в структуре пептида остатка аргинина послужили результаты опытов по оценке влияния на пролиферацию седатина (H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH) и его безаргининового аналога (H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH).

Пятикратное введение седатина в дозе 100 мкг/кг индуцировало выраженную стимуляцию процессов синтеза ДНК в эпителии СОЖ - ИМЯ увеличился в 1,6 раза, ИМ при этом не изменялась (табл. 1).

Таблица 1 Влияние пятикратного введения аналогов дерморфина на процессы синтеза ДНК в эпителии желудка белых крыс (M ± m)

Примечание: * p<0,05

Безаргининовый аналог не оказал влияния на процессы синтеза ДНК. Аналогичная картина имела место в опытах с другим аргининсодержащим опиатным пептидом даларгином. В то время, как даларгин (Tyr-DAla-Gly-Phe-Leu-Arg), стимулировал синтез ДНК в эпителии фундального отдела желудка, его безаргининовый аналог утрачивал эту способность (Животова Е.Ю и соавт., 2007). На примере даларгина было показано, что в начальный период метаболизма in vivo происходит отщепление остатка аргинина от молекулы пептида. Aргинин является важным фактором фунционирования системы NOS-NO, которая, в свою очередь, является ключевым фактором поддержания кровотока в желудке, обеспечивающего поддержание целостности СОЖ. Для оценки роли этого механизма в реализации митогенного действия седатина были проведены эксперименты с блокадой NOS с помощью L-NAME. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Влияние пятикратного введения седатина и L-NAME на процессы синтеза ДНК в эпителии желудка белых крыс (M ± m)

Примечание: * p<0,05

Наши данные совпадают с результатами исследований, в которых введение L-NAME приводило к угнетению синтеза ДНК в миокарде новорожденных крыс. При этом, в эпителии кожи и в мышечной оболочке кишечника синтез ДНК не изменялся (Сазонова Е.Н., Пикалова В.М., Тимошин С.С., 2002). Введение седатина на фоне L-NAME не оказало влияния на процессы пролиферации по сравнению с группой животных, получавших только L-NAME. Эти эксперименты подтвердили важную роль тонического влияния NO-NOS на поддержание тканевого гомеостаза в СОЖ. Блокада NOS привела к выраженному угнетению синтеза ДНК в СОЖ. ИМЯ уменьшился в 1,6 раза. Уменьшение числа ДНК-синтезирующих ядер сопровождалось уменьшением ИМ, свидетельствующим о замедлении скорости синтеза ДНК. Такая же закономерность имела место в эксперименте с даларгином. Введение его на фоне L-NAME отменяло способность стимулировать синтез ДНК в СОЖ (Животова Е.Ю и соавт., 2007).

Результаты этих исследований, в определенной степени, объясняют механизмы, через которые аргининсодержащие опиоидные пептиды реализуют свое воздействие на тканевой гомеостаз. Несмотря на наличие общих свойств у даларгина и седатина, некоторые физиологические и цитофизиологицеские эффекты различны. Оба пептида обладают антистрессорной активностью, при этом даларгин оказывает гипотензивное и релаксирующее влияние, а седатин повышает концентрацию внимания. В наших экспериментах седатин и его безаргининовый аналог не оказывали влияния на процессы синтеза ДНК в дермальных фибробластах in vitro. В опытах Е.Ю. Животовой (2010) даларгин стимулировал синтез ДНК в фибробластах. Аппликация седатина на роговицу не оказывала влияния на синтез ДНК, в то время, как даларгин в этих условиях оказывал стимулирующее влияние.

Особо следует подчеркнуть способность седатина стимулировать синтез ДНК в эпителии желудка в широком диапазоне доз от 0,1 мкг/кг до 1 мг/кг (табл. 3).

Таблица 3. Влияние пятикратного введения различных доз седатина на процессы синтеза ДНК в эпителии желудка белых крыс (M ± m)