Материал: Молекулярно-генетическое исследование гибридизации степного орла и орла-могильника в природных популяциях

5.5 Ядерные маркеры

Нами были проанализированы последовательности фрагмента 6 экзона аденилаткиназы 1 у 4 степных орлов, 1 могильника, 2 предполагаемых гибридов. Поскольку полиморфизм по данному участку представляет собой двухбуквенную инсерцию, в случае гетерозиготы интерпретация

Рисунок 10. Хроматограмма с двухбуквенной инсерцией в гетерозиготе.

Результаты анализа в программе BLAST и полного выравнивания представлены в Таблице 3 и на Рисунке 11 соответственно (степной орел, могильник, беркут).

Таблица 3. Результаты анализа в программе BLAST

* гетерозигота определялась визуально по наложению пиков на хроматограмме

Для 6 экзона аденилаткиназы 1 в 1 случае мы наблюдали двухбуквенную инсерцию в гомозиготе у птицы с фенотипом и митохондриальным геномом степного орла. Оба предполагаемых гибрида имели инсерцию в гетерозиготе. Ранее зафиксированные полиморфизмы по сайтам 204, 270, 298 в 7 интроне бета-фибриногена оказались неспецифичны для степного орла и могильника. По сайту 210 мы не наблюдали гетерозиготы или замены у

степного орла.

Последовательность 7 интрона бета-фибриногена образца 162AN совпала с последовательностями степного орла и могильника на 97%, но на 99% соответствовала последовательности этого участка у черного грифа (Aegypius monachus) и на 99% у африканского ушастого грифа (Torgos tracheliotos) (рис. 11). Поскольку местом сбора образца является Алтае- Саянский регион - участок ареала только черного грифа - данный образец был определен как линное перо Aegypius monachus.

Рисунок 11. Результат проверки последовательности 7 интрона бета-фибриногена образца 162AN в программе BLAST (NCBI, США)

6. Обсуждение результатов

6.1 Определение пола

Подтверждение возможности интрогрессии митохондриального генома. По результатам определения пола предполагаемые гибриды являются самками, следовательно, возможна дальнейшая интрогрессия митохондриального генома орла могильника в геном степного орла у их потомков.

Определение пола у филинов. Полученные нами результаты ПЦР с универсальными праймерами для определения пола у птенцов филина Bubo bubo не только иллюстрируют возможности молекулярно-генетического анализа в исследованиях природных популяций хищных птиц, но и имеют фундаментальное и практическое значение. Ранее считалось (Wang, et al., 2008), что у европейского филина и нескольких удаленных видов сов (болотной совы и пятнистой совки) размер интрона в гене хеликазы CHD1 в половых хромосомах W и Z совпадают, что довольно трудно объяснить с точки зрения эволюции нерекомбинирующих половых хромосом у сов. Кроме того, в силу большого размера ПЦР-продукта W-хромосомы у сов (Fridolfsson, et al., 1999) данную методику невозможно использовать для определения их пола по линным перьям, где ДНК сильно фрагментирована, и даже для крови и перьевых трубок птенцов существует значительная вероятность ошибочного определения самки как самца. Наши результаты указывают на то, что у европейского филина размер интрона гена CHD1 W-хромосомы такой же, как у прочих сов. Для окончательного подтверждения этого результата необходимо установить последовательность ПЦР-продуктов путем секвенирования, что позволит в дальнейшем разработать на основе последовательностей интрона гена CHD1 W и Z-хромосом систему молекулярного определения пола для филина и, возможно, для других сов, пригодную для определения пола по линным перьям.

6.2 Ядерные маркеры

Оба фрагмента у степного орла и могильника несут предковые полиморфизмы и не могут каждый в отдельности служить для выявления гибридов, что хорошо согласуется с известными данными для иных ядерных маркеров - у венгерских коллег (Szilvia, 2015).

Однако выбранный нами фрагмент бета-фибриногена позволил определить линное перо черного грифа. Таким образом, 7 интрон бета- фибриногена не является подходящим маркером для выявления гибридов степного орла и орла могильника, однако является маркёром для более удалённых видов (чёрного грифа Aegypius monachus) и может быть использован для определения видовой принадлежности линных перьев, собранных в природе.

6.3 Критерии вида

Выявление межвидовой гибридизации даёт основания задуматься о критериях вида и видообразовании. Становится ясно, что критерий репродуктивной изоляции уже не является решающим при присвоении видового статуса.

Как отметил Гаррисон (Harrison, et al., 2014), репродуктивная изоляция является характеристикой не целого генома, а каких-то областей генома. Это позволяет границам вида быть полупроницаемыми. Благодаря такой полупроницаемости происходит гибридизация между видами. Но даже если два вида скрещиваются, у них некоторая часть генотипа остаётся не подверженной гибридизации. Поэтому эти два вида по сути остаются «репродуктивно изолированными» в том смысле, что они не сливаются в одну популяцию, несмотря на утечку некоторых генов.

Выводы

1.        Последовательность 3 интрона гена лактатдегидрогеназы у степного орла и орла могильника совпадает полностью, в 7 интроне бета- фибриногена наблюдаются мононуклеотидные замены, 6 экзон гена аденилаткиназы 1 у орла могильника содержит двухбуквенную инсерцию.

2.       Предполагаемые природные гибриды являются самками и могут служить источником интрогрессии митохондриального генома орла могильника в популяции степного орла.

.         Универсальные праймеры 2550F и 2718R для определения пола у птиц позволяют получить ПЦР-продукты, характерные для большинства сов, у европейского филина Bubo bubo.

.         Выбранные фрагменты 7 интрона бета-фибриногена и 6 экзона аденилаткиназы 1 содержат общие для двух видов сайты полиморфизма, однако комбинация детектированных замен указывает на гибридное происхождение исследованных птиц.

.         Выбранные фрагменты ядерного генома не могут служить эффективными маркерами для выявления природных гибридов степного орла и орла могильника, однако 7 интрон бета-фибриногена является маркёром для более удалённых видов (чёрного грифа Aegypius monachus) и может быть использован для определения видовой принадлежности линных перьев, собранных в природе.

.         В настоящее время в природных популяциях степного орла и орла могильника происходит межвидовая гибридизация, приводящая к интрогрессии митохондриального генома орла могильника в популяции степного орла и ядерного генома степного орла - в популяции могильника.

Степной орел и орел могильник являются близкородственными видами с отсутствием строгой репродуктивной изоляции и высокой гомологией ядерных геномов. При сокращении их численности происходит взламывание изолирующих барьеров, приводящее к интрогрессии генома одного вида в популяции другого и размыванию межвидовых различий. Явление межвидовой гибридизации может стать угрозой для существования степного орла как вида в ареале орла могильника.

Для дальнейшего изучения экологической и эволюционной роли межвидовой гибридизации необходимо:

1.        Сравнить полные последовательности ядерного и митохондриального геномов степного орла и орла могильника методами NGS для выявления статусных генов, ответственных за межвидовые различия.

2.       Провести множественные сравнения видоспецифических морфологических и поведенческих признаков и ядерных маркеров для выявления генетических основ видоспецифических различий.

Список литературы

1.      Altukhov Yu. P. Intraspecific Genetic Diversity. Monitoring, Conservation and Management [Книга]. - Berlin : Heidelberg: Springer-Verlag, 2006. - Т. 10.1007/3-540-30963-2.

2.       Anderson Edgar INTROGRESSIVE HYBRIDIZATION [Книга]. - New York, London : John Wiley & Sons, Chapman & Hall, Limited/, 1949. - PAUL A., DAVID R., FRANCIS O.

3.       Fridolfsson AK и Ellegren H A simple and universal method for molecular sexing of non-ratite birds. [Статья] // J Avian Biol. 30:116-121. - 1999 г.

4.       Grebelnyi The mechanisms of unisexual reproduction and pure either maternal or paternal inheritance. [Отчет]. - St. Petersburg : Zoological Institute, Russian Academy of Sciences, 2000.

5.      Harrison Richard G. и Larson Erica L. Hybridization, Introgression, and the Nature of Species Boundaries [Статья] // Journal of Heredity, 105 (S1): 795-809. - 2014 г.

6.      Horváth MB [и др.] An overlooked DNA source for non-invasive genetic analysis in birds [Статья] // J Avian Biol, 36:84-88. - 2005 г.

7.       McCarthy Eugene M. Handbook of Avian Hybrids of the World [Книга]. - New York : Oxford University Press, Inc., 2006.

8.       Olszewski A. и Matusiak J. Breeding of a mixed pair of the Greater Spotted Eagle Clanga clanga and the Lesser Spotted Eagle Clanga pomarina in Central Poland. - Warshawa : Kampinos National Park., 2016 г. - Т. 5.

9.       Randler C. Avian hybridization, mixed pairing and female choice. [Журнал]. - [б.м.] : Animal Behaviour., 2002 г. - 1 : Т. 63.

10.     Rhymer JM, Williams MJ и Braun MJ Mitochondrial analysis of gene flow between New Zealand mallards (Anas platyrhynchos) and grey ducks (A. superciliosa). [Журнал]. - [б.м.] : Auk 111:970-978., 1994 г.

11.    Sanger F., Niclein S. и Coulson A.R. DNA sequencing with chain- terminating inhibitors [Статья] // Proc Natl Acad Sci USA. С. 5463-5467. - 1977 г. - Т. Т. 74.

12.    Svardson G. Chromosome studies on Salmonidae. [Статья] // Fish Res. - Drottingholm : Rep. Swed. State Ins., 1945 г. - 23:1-51.

13.     Szilvia Jakab A parlagi sas (Aquila Heliaca) és a pusztai sas (Aquila Nipalensis) hibridizációjának molekuláris vizsgálata [Журнал]. - 2015 г.

14.     VÄLI Ü. Mitochondrial pseudo-control region in old world eagles (genus Aquila) [Статья] // Molecular Ecology. - Tartu : Institute of Zoology and Hydrobiology, University of Tartu., 2002 г. - 11.

15.     Wang L.C. [и др.] Sex identification of owls (family Strigidae) using oligonucleotide microarrays. [Статья] // The Journal of Heredity 99: 187-192. - 2008 г.

16.     Zink Robert M. The role of subspecies in obscuring avian biological diversity and misleading conservation policy. [Книга]. - London : The Royal Society, 2004.

17.     Абрамсон Н. И. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ, ФИЛОГЕОГРАФИЯ И ПОИСК КРИТЕРИЯ РАЗГРАНИЧЕНИЯ ВИДОВ. [Статья] // Труды Зоологического института РАН. - Санкт Петербург : Зоологический институт РАН, 2009 г. - Приложение № 1.

19.    Алтухов Ю. П. Генетические процессы в популяциях. [Книга]. -

Москва : ИКЦ «Академкнига», 2003. - Т. 431 c.

20.    Боркин Л. Я. и Даревский И. С. Сетчатое (гибридогенное) видообразование у позвоночных. С. 485-506. [Журнал]. - [б.м.] : Журн. общ. биол., 1980 г. - 4 : Т. 41.

21.    Боркин Л. Я. и Литвинчук С. Н. ГИБРИДИЗАЦИЯ, ВИДООБРАЗОВАНИЕ И СИСТЕМАТИКА ЖИВОТНЫХ. [Статья] // Труды

Зоологического института РАН. - Санкт-Петербург, : Зоологический институт, Российская академия наук, 2013 г. - Приложение № 2,.

22.    Боркин Л. Я. Сетчатое видообразование: эволюция не по Дарвину? // Доклад. - Санкт-Петербург : Зоологический институт РАН, 2010 г.

23.     Бурковский О. А. и Васик О. Н. Первая регистрация гибрида бургомистра Larus hyperboreus и восточносибирской чайки L. vegae у берегов Южного Приморья. [Журнал]. - [б.м.] : Русский орнитологический журнал, 2016 г. - 1266 : Т. 26.

24.     Водолажский Д.И. Вимерс М., Страдомский Б.В. Сравнительный анализ последовательностей митохондриальной и ядерной ДНК голубянок подрода Polyommatus (s. str.) Latreille, 1804 (Lepidoptera: Lycaenidae: Polyommatus). [Статья] // Кавказский энтомол. бюллетень. - [б.м.] : CAUCASIAN ENTOMOLOGICAL BULL., 2009 г. - 5 (1).

25.     Вяли Ю.И. и Лыхмус А.А. Актуальные проблемы изучения и охраны птиц Восточной Европы и Северной Азии. Материалы Международной конференции (XI Орнитологическая конференция). С. 154- 155 [Конференция] // Характеристика гибридов большого и малого подорлика (Aquila clanga x pomarina). - Казань : [б.н.], 2001.

26.    Глик Б. и Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. [Книга]. - Москва : Мир, 2002.

27.    Глущенко Ю. Н. Темпы пополнения авифаунистического списка Приморского края в начале XXI столетия. [Статья] // ЖИВОТНЫЙ И РАСТИТЕЛЬНЫЙ МИР ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА. - Владивосток : Дальневосточный федеральный университет, 2016 г. - Научное электронное издание.

28.     Грант В. Эволюция организмов. [Книга]. - Москва : Мир, 1982.

29.     Дарвин Ч. Происхождение видов путём естественного отбора, или Сохранение благоприятных рас в борьбе за жизнь (On the Origin of Species by Means of Natural Selection, or the Preservation of Favoured Races in the Struggle

for Life). [Книга]. - Лондон (1859), Санкт-Петербург : «НАУКА», 1991 -

перевод 6-го издания.

30.    Даревский И. С. Видообразование путем гибридизации у животных. [Статья] // Методы исследования в экологии и этологии. - Пущино : НЦ биол иссл. АН СССР, 1986 г. - Сборник трудов. - С. 35-73.

31.     Домбровский В.Ч. Гибридизация малого (Aquila pomarina) и большого (Aquila clanga) подорликов в Беларуси: правило или исключение? [Статья] // Subbuteo №5(1). С. 23-31. - 2002 г.

32.     Заславский В.А. Репродуктивное самоуничтожение как экологический фактор (экологические последствия генетического взаимодействия популяций). [Журнал]. - [б.м.] : Журнал общей биологии., 1967 г. - 1 : Т. 28.

33.     Зиневич Л.С. [и др.] Генетическое разнообразие популяций степного орла в условиях быстрого сокращения численности вида. [15- Zinevich-etal-21-09-2016.pdf]. - ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН; ООО «Сибэкоцентр». : при поддержке проекта ПРООН/ГЭФ/Минприроды России «Совершенствование системы и механизмов управления ООПТ в степном биоме России»., 2016 г.

34.    Карташов Н. Н. Систематика птиц. [Книга]. - Москва : «Высшая школа», 1974.

35.    Карякин И.В. [и др.] ПОПУЛЯЦИОННАЯ СТРУКТУРА АРЕАЛА СТЕПНОГО ОРЛА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ ПО ГЕНЕТИЧЕСКОМУ РАЗНООБРАЗИЮ ЕГО ПОПУЛЯЦИЙ И СТАТУСУ ПОДВИДОВ. [Журнал]. - [б.м.] : Журнал «Пернатые хищники и их охрана / Raptors Conservation», 2016 г. - 32.

36.     Карякин И.В. Коваленко А.В., ПЕРВЫЙ СЛУЧАЙ УСПЕШНОГО ВЫВЕДЕНИЯ ПОТОМСТВА СМЕШАННОЙ ПАРОЙ СТЕПНОГО ОРЛА И ОРЛА-МОГИЛЬНИКА В ЗАПАДНОМ КАЗАХСТАНЕ И РЕГИСТРАЦИИ ВЕРОЯТНЫХ ГИБРИДОВ МЕЖДУ СТЕПНЫМ ОРЛОМ И ОРЛОМ-МОГИЛЬНИКОМ В РОССИИ И КАЗАХСТАНЕ. [Журнал]. - [б.м.] : Пернатые хищники и их охрана, 2016 г. - 32.

37.    Кирпичников В.С. Генетические основы селекции рыб [Книга]. -

Ленинград : Наука, 1979.

38.    Коблик Евгений А. Разнообразие птиц (по материалам экспозиции зоологического музея МГУ). [Книга]. - Москва : Ордена "Знак почета" издательство Московского университета, 2001. - Т. 1-4.

39.     Кобозева Е.В. ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук. // Видовая специфичность и таксономические взамоотношения видов StY-геномной группы рода Elymus L. Азиатской России. - Новосибирск : [б.н.], 2014 г.

40.     Коляда А.С. (составитель) Животный и растительный мир Дальнего Востока. [Статья]. - Владивосток : Дальневосточный федеральный университет, 2016 г. - Электронный ресурс. - 27.

41.    Комиссия по генетическим ресурсам в сфере продовольствия и сельского хозяйства. Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций. Молекулярные маркеры - инструмент исследования генетического разнообразия. [Отчет]. - Рим-Москва : Agriculture and Consumer Protection, 2010.

42.    Лотси Я. Опыты с видовыми гибридами и соображения о возможности эволюции при постоянстве видов. [Раздел книги] // Новые идеи в биологии. Сборник 4. С Наследственность I. С. 112-123. - СПб. : Образование, 1914.