Материал: Молекулярно-генетическое исследование гибридизации степного орла и орла-могильника в природных популяциях

увалах, одиноких деревьях, линиях ЛЭП (из-за чего много птиц гибнет), иногда на ровной земле.

Степной орел Aquila nipalensis до недавнего времени был самым многочисленным видом орлов Северной Евразии. С 2015 года степной орел включен в Красный лист МСОП в статусе критически угрожаемого. Мировая численность степного орла составляет 26-36,7 тыс. гнездящихся пар, основной ресурс вида сосредоточен в Казахстане (данные

1.4 Гибридизация в роде Aquila

Гибридизация в роде Aquila встречается в природе нечасто. Описаны гибриды для большого (A. clanga) и малого (A. pomarina) подорликов в зоне их контакта в Польше, Беларуси, Прибалтике, на северо-западе Украины и Европейской части России (Вяли, и др., 2001); (Домбровский, 2002). Вероятно, причиной гибридизации этих видов служит антропогенное изменение местности, осушение и мелиорация болотных массивов - основных местообитаний большого подорлика. Это привело к вселению малого подорлика, самцы которого явились лучшими добытчиками пропитания в изменившихся условиях.

Известны случаи естественной гибридизации беркута (Aquila chrysaetos) с испанским орлом-могильником (Aquila [heliaca] adalberti) и малым подорликом в Испании (McCarthy, 2006). Там же установлена гибридизация между степным орлом и испанским орлом-могильником (R. Sanchez, pers. сomm; цитировано по Карякин, 2016).

В Турции наблюдалась смешанная пара степного орла (самец) и орла- могильника (самка), позже установлено успешное размножение этой пары (M. Horvath, pers. сomm; цитировано по Карякин, 2016).

В Западном Казахстане, начиная с 2006 г., началось заметное сокращение численности степного орла и одновременный рост численности орла-могильника, который стал занимать места обитания степного орла. В зоне контакта обоих видов на севере и юго-западе Западного Казахстана (кромка Урдинских песков) происходит формирование смешанных пар.

На кромке Урдинских песков в 2013 г. в одном из гнёзд, ранее занимаемым степным орлом, была обнаружена самка, идентифицированная как гибрид степного орла и орла-могильника (AH-K1A - один из исследуемых нами образцов), и самец - орёл-могильник. В гнезде находился 1 птенец, близкий по окраске к орлу-могильнику, имеющий отличие лишь в более тёмном буром фоне кроющих верха крыла (рис.3).

Рисунок 3. Гнездо (E, F), взрослая самка (А, В) и оперяющийся птенец (C, D) вероятного гибрида степного орла и орла-могильника. 18.06.2013. Фото И. Карякина.

Кроме того, 21 июня 2013 г. в бассейне р. Есенанкаты было проверено гнездо степного орла, известное с 2006 г. В гнезде была обнаружена взрослая самка орла-могильника и самец степного орла, принёсший добычу самке.

июня 2015 г. на водоразделе рек Утва и Киыл было обнаружено гнездо, известное с 2014 г. В гнезде находилась самка орла-могильника и 3 пуховых птенца. Самец степного орла 4-х летнего возраста принёс самке добычу.

Гибридизация между степным орлом и орлом-могильником происходит не только в Западном Казахстане.

В 2005 г. в Бетпак-Далы было обнаружено гнездо, в котором сидела самка орла-могильника, а над ней летал самец степного орла (позже гнездо не проверялось).

На Сорбулаке близ пос. Караой в Юго-восточном Казахстане в 2014 г. наблюдался вероятный гибрид степного орла и орла-могильника. Внешне орёл был близок по окраске к полувзрослому орлу-могильнику, но имел специфическую охристую окраску темени и характерную для молодого степного орла белую ювенильную полосу по низу крыла (Беляев, 2014; Коваленко, 2014).

Близкая по окраске птица (вероятный гибрид A. heliaca × nipalensis) была встречена в 2015 г. на юге Оренбургской области близ Орска в скоплении из 4 степных орлов, 2 орлов-могильников, нескольких курганников и коршунов.

В 2010 г. в Даурии в гнезде на земле (рис. 4.) были найдены линные перья (как изначально думалось, степного орла). Однако анализ D-петли митохондриальной ДНК показал, что гаплотип идентичен одному из гаплотипов орла-могильника. Возможно, речь идёт об интрогрессии митохондриального генома могильника в геном степного орла, что может отражать события гибридизации могильника со степным орлом при невозможности создать пару с особью своего вида. Или же имела место попытка размножения смешанной пары. Данный образец пера включён в исследование.

Рисунок 4. а - гнездо степного орла в Даурии, 2010 г.; б - предполагаемый хозяин собранного пера. Фото И. Карякина

Все случаи формирования смешанных пар выявлены в зоне контакта двух видов по периферии ареала степного орла при сокращении численности одного (степного орла) и росте другого (как в Западном Казахстане), либо при сокращении численности обоих и недостатке партнёров своего вида (как в Даурии).

2. Молекулярные методы определения видов

2.1 Методы (ПЦР, секвенирование)

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является одним из самых универсальных, высокочувствительных и относительно простых в исполнении

молекулярных методов, который используется во многих областях биологии. ПЦР представляет собой многократное копирование ДНК, которое проводится in vitro. В процессе принимают участие 2 коротких олигонуклеотида (праймера), которые гибридизуют противоположные концы интересующей нас последовательности ДНК; фермент, катализирующий синтез новой цепи (чаще всего используют термостабильную ДНК- полимеразу I - Taq-полимеразу, выделенную из бактерии Thermus aquaticus); смесь четырёх дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ), из которых строится новая цепь; реакционный буфер; вода; матрица в виде растворённой ДНК.

Подготовленная смесь в пробирках помещается в амплификатор, где циклически в 3 этапа (денатурация, отжиг праймеров, элонгация) происходит реакция копирования ДНК. Каждому этапу цикла свойственна определённая температура. На выходе получается большое количество копий исходной матрицы, которые затем используют для идентификации нуклеотидной последовательности с помощью метода секвенирования.

Секвенирование представляет собой определение нуклеотидной или аминокислотной последовательности. Секвенирование ДНК (sequencing) - это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. В настоящее время нет ни одного метода секвенирования, который бы работал для молекулы ДНК целиком; все они устроены так: сначала готовится большое число небольших участков ДНК (молекула ДНК многократно клонируется и «разрезается» в случайных местах), а потом читается каждый участок по отдельности. Широко используемым вариантом секвенирования небольших ПЦР-фрагментов является секвенирование по Сэнгеру (метод обрыва цепи).

Для реакции требуются праймеры, гибридизующие специфические участки нужной цепи ДНК; четыре пробирки, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида (один из них - изотопно меченный) и один из четырёх дидезоксинуклеотидов (ддНТФ). Дидезоксинуклеотид - искусственно полученный нуклеотид, лишённый 2’- и 3’-гидроксильных групп при углеродных атомах сахарного кольца. Поскольку в норме у дезоксинуклеотида отсутствует лишь 2’-гидроксильная группа, а удлинение цепи во время репликации ДНК происходит в результате присоединения нуклеозидтрифосфата к 3’-гидроксильной группе, то при присоединении дидезоксинуклеотида (с отсутствующей 3’-гидроксильной группой) синтез цепи останавливается. Остановка синтеза является ключевым этапом в методе Сэнгера (Sanger, et al., 1977).

После окончания ферментативного синтеза при участии ДНК- полимеразы в каждой пробирке оказывается уникальный набор олигонуклеотидов, каждый из которых содержит праймерную последовательность. Затем в пробирки добавляют формамид, обеспечивающий расхождение цепей, и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырёх дорожках. Такой процесс позволяет разделить одноцепочечные фрагменты ДНК (Глик, и др., 2002). Современные приборы позволяют проводить капиллярный электрофорез, с помощью которого молекулы разделяются по заряду и размеру в заполненном электролитом тонком капилляре. Анализ продуктов секвенирования проводят на различных секвенаторах, далее результаты обрабатывают с помощью программных пакетов.

2.2 Маркеры (баркод и др.)

Молекулярными, или генетическими маркерами называются анализируемые фрагменты ДНК, которые соответствуют гену или некодирующему участку генома и различаются по вариантам аллелей у исследуемых таксономических групп. Основные классы молекулярных маркеров (Хлесткина, 2013) приведены ниже:

•  AFLP (amplified fragment length polymorphism) - полиморфизм длины амплифицированных фрагментов.

•   CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences) - расщепленные амплифицированные полиморфные последовательности.

•   DArT (diversity array technology) - ДНК-чип технология для изучения разнообразия.

•  IRAP (inter-retrotransposon amplified polуmorphism) - полиморфизм амплифицированных последовательностей между ретротранспозонами.

•  ISSR (inter simple sequence repeats) - межмикросателлитные последовательности.

•   RAPD (random amplified polymorphic DNA) - случайно амплифицированная полиморфная ДНК.

•   RFLP (restriction fragment length polymorphism) - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов.

•   SCAR (sequence characterized amplified region) - амплифицированная область, охарактеризованная нуклеотидной последовательностью.

•   SNP (single-nucleotide polymorphism) - однонуклеотидный полиморфизм.

•   SSAP (sequence-specific amplification polymorphism) - полиморфизм сиквенс-специфичной амплификации.

•   SSCP (single strand conformation polуmorphism) - полиморфизм конформации одноцепочечной ДНК.

•   SSR (simple sequence repeats) - простые повторяющиеся последовательности (микросателлиты).

•   STS (sequence tagged site) - сайт/локус, маркированный нуклеотидной последовательностью.

Данные маркеры могут исследоваться с помощью разных методов, таких как блот-гибридизация, ПЦР-реакция и ДНК-чипы. Молекулярные маркеры широко используются в популяционной генетике, в исследованиях генетического разнообразия и в филогенетических исследованиях.

Одним из способов молекулярной идентификации вида зявляется т.н. баркодирование или «штрих-кодирование» ДНК. Баркодом являются общие для разных видов короткие маркеры (500-600 bp) в последовательности митохондриальной ДНК, для которых показано наличие межвидового полиморфизма. У позвоночных это, как правило, фрагменты гена цитохрома b, у беспозвоночных - первая субъединица цитохромоксидазы - COI. На основании уже установленных последовательностей ДНК-баркода строится филогенетическое дерево видов, в результате чего методом ДНК-баркодинга можно определять таксономическую принадлежность неизвестного образца в рамках уже известной классификации (Абрамсон, 2009).

2.3 Молекулярно-генетические исследования видов рода Aquila

В России исследования по генетическому разнообразию орла- могильника Aquila heliaca не проводились, однако популяции этих птиц изучались на территориях Испании, Словакии и Казахстана.

Генетическое разнообразие степного орла практически не изучено. В работе Зиневич Л.С. с соавторами (Зиневич, и др., 2016) впервые было предпринять исследование разнообразия и состояния природных популяций степного орла методами молекулярной генетики.

Для целей молекулярно-генетического исследования был использован «золотой стандарт» неинвазивных методов в популяционной генетике хищных птиц - выделение ДНК из линных перьев. Были исследованы 94 образца: 83 степных орла, 10 могильников, 1 гибрид. В качестве маркера определена последовательность контрольного района (D-петли) митохондриального генома. Анализ проводили с помощью ПЦР и секвенирования по Сэнгеру полной последовательности D-петли с использованием библиотеки специфических праймеров. На завершающей стадии использовался филогенетический анализ гаплотипов методом максимальной парсимонии и анализ их распределения в ранее выделенных популяционных группировках.

Результатом анализа структуры D-петли рода Aquila стали новые данные: гибридизация генетический aquila секвенирование

•    впервые установлена полная последовательность D-петли степного орла, а также орла могильника; среднее значение попарных генетических расстояний между степным орлом и могильником по данным мтДНК составляет 0.25;

•   гипервариабельный участок D-петли содержит 7 сайтов однонуклеотидных замен; данный фрагмент является информативным для исследования внутривидового разнообразия на уровне данного вида.

Путем анализа гипервариабельного участка D-петли авторы пришли к заключениям, что:

•   наиболее древний гаплотип A и его ближайшие производные B и J встречаются только в отдельных популяциях: Калмыцкой и Западноказахстанской на западе, и Западномонгольской и Тувинской на востоке - предположительных центрах видообразования;

•   не выявлено специфических групп гаплотипов для западных и восточных популяций;

•   гипервариабельный участок D-петли является перспективным маркером для оценки состояния генетического разнообразия популяций степного орла.

•   Для выявления случаев природной гибридизации степного орла и орла могильника требуется поиск молекулярных маркеров.

По результатам определения последовательности контрольного региона (D-петли) митохондриального генома степного орла было выявлено два случая предполагаемой интрогрессии митохондриального генома орла- могильника в геном степного орла (Зиневич, и др., 2016). Поскольку фенотипически птицы также имели признаки гибридизации, наши дальнейшие исследования посвящены выявлению молекулярных маркеров в ядерном геноме этих птиц.

3. Постановка проблемы исследования

Несмотря на большое количество описанных случаев гибридизации степного орла и орла могильника в природе и об успешном размножении фертильных гибридов, до сих пор не существует подтверждения фактов гибридизации методами молекулярно-генетического анализа. Выявленные нами случаи формирования смешанных пар наблюдаются в зоне контакта двух видов по периферии ареала степного орла при сокращении численности одного (степного орла) и росте другого (в Западном Казахстане), либо при сокращении численности обоих и недостатке партнёров своего вида (в Даурии). Поскольку численность степного орла продолжает сокращаться, процесс гибридизации может усилиться и это явление требует более тщательного изучения, однако до настоящего времени не выявлено надежных маркеров, позволяющих выявлять случаи природной гибридизации между этими видами.

Поиск эффективных молекулярных маркеров, позволяющих подтвердить и исследовать явление межвидовой гибридизации малочисленных и стремительно исчезающих видов хищных птиц - орла- могильника и степного орла в природе, является актуальной научной проблемой, разрешение которой также имеет практическое значение для выработки стратегий по сохранению популяций редких птиц.

4. Материалы и методы

1.        Выделение ДНК из мезенхимы пера

2.       Разработка специфических праймеров

.         Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

.         Горизонтальный электрофорез

.         Секвенирование по Сэнгеру

6.         Обработка результатов

4.1 Выделение ДНК