Материал: Молекулярно-генетическое исследование гибридизации степного орла и орла-могильника в природных популяциях

Молекулярно-генетическое исследование гибридизации степного орла и орла-могильника в природных популяциях

Оглавление

Введение

. Литературный обзор

.1 Эволюционные теории и гибридизация

.2 Фенотипические последствия гибридизации (примеры у птиц)

.3 Характеристика исследуемых видов

.3.1 Орёл-могильник

.3.2 Степной орёл

.4 Гибридизация в роде Aquila

. Молекулярные методы определения видов

.1 Методы (ПЦР, секвенирование)

.2 Маркеры (баркод и др.)

.3 Молекулярно-генетические исследования видов рода Aquila

. Постановка проблемы исследования

. Материалы и методы

.1 Выделение ДНК

.2 Разработка специфических праймеров для ПЦР

.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

.4 Горизонтальный электрофорез

.5 Очистка ПЦР-фрагментов в агарозном геле

.6 Секвенирование по Сэнгеру

.7 Обработка результатов

. Результаты

.1 Поиск маркеров

.2 Подбор праймеров

.3 Характеристика образцов предполагаемых гибридов

.4 Определение пола

.5 Ядерные маркеры

. Обсуждение результатов

.1 Определение пола

.2 Ядерные маркеры

.3 Критерии вида

Выводы

Список литературы

Введение

Актуальность проблемы. Дарвин не зря назвал свой главный труд «Происхождением видов». Он понимал, что видообразование - основной процесс биологической эволюции (Дарвин, 1991 - перевод 6-го издания). С точки зрения Дарвина ветви эволюционного древа с течением времени все более удаляются друг от друга, что означает необратимость дивергенции видов, произошедших некогда от общего предка. Вместе с тем, во второй половине ХХ в. сформировалась концепция, противоречащая теории традиционной дарвиновской дивергентной эволюции и допускающая вторичное «срастание молодых, концевых побегов» древа эволюции в результате гибридизации и формирование гибридогенных общностей (популяций, видов) с новыми свойствами и с неожиданными вариациями развития. (Дарвин, 1991 - перевод 6-го издания), (Северцов, 1988).

Свою статью «Межвидовая гибридизация у птиц: эволюция в действии» (Панов, 2001) один из ведущих специалистов в области этологии Евгений Николаевич Панов начал с цитаты: «Все, чего мы достигаем искусством, может осуществляться тысячи и тысячи раз природой, и таким образом часто получаются случайные и добровольные смешения между животными, и особенно - между птицами.. Кто может сосчитать незаконные утехи между особями разных видов! Кто сумеет когда-нибудь отделить бастардные ответвления от законных стволов, определить время их первого возникновения, установить, одним словом, все следствия могущества Природы <..> которое она знает, как применить для увеличения числа видов и заполнения перерывов, их разделяющих». Так писал великий французский натуралист Ж. Бюффон в «Естественной истории птиц» (1770). Эти слова можно рассматривать в качестве одной из первых формулировок оформившейся концепции ретикулярной, или сетчатой, эволюции, основанной на гибридизации (Панов, 2001).

Межвидовая гибридизация у птиц встречается очень часто (отмечена между 850 видами, это 10% мировой фауны). Случаи гибридизации учащаются, когда один из двух гибридизируемых видов встречается редко. Уже один этот факт говорит, что гибридизация относится к существенным лимитирующим факторам, отрицательно влияющим на состояние популяций редких видов птиц (Хубиев, и др., 2012).

Одна из основных причин межвидовой гибридизации (в частном случае

-         слияния видов) - нарушение естественных процессов под воздействием антропогенных факторов (Панов, 1993). Влияние человека на окружающую среду не проходит бесследно и один из показательных итогов - исчезновение на Земле различных видов представителей флоры и фауны. Существенна ли роль гибридизации в их исчезновении? Наше исследование, в этой связи, вызвано определенным интересом изучения влияния гибридизации на популяции двух малочисленных, занесенных в Красную Книгу, видов птиц - степного орла и орла могильника, факты гибридизации которых неоднократно отмечены наблюдателями и исследователями. Может ли межвидовая гибридизация стать угрозой для существования одного из видов?

Термин «вид» впервые был предложен еще Аристотелем как совокупность объектов, объединяемых по сходству. Лишь через 2000 лет, в 1693 г., английский натуралист Дж. Рей придал понятию «вид» биологический смысл. Согласно Рею, биологический вид - это совокупность особей, которые объединяются по двум критериям: практической тождественности морфологических признаков и свободному скрещиванию с воспроизведением признаков в потомстве. Теперь же, большинство исследователей приходят к выводу, что морфологический критерий для определения вида недостаточен (Медников, и др., 2001). К определению вида присоединились генетики, взяв на вооружение принцип генетической изоляции видов. Однако исследования по достоверным маркерам генетической специфичности вида малочисленны и стали возможны лишь благодаря появлению новейших молекулярно- генетических методов. Поиск и изучение специфичных молекулярно-

генетических маркеров, достоверно идентифицирующих видовые различия, является актуальной задачей на пути изучения эволюции видов и факторов на неё влияющих.

Цели и задачи исследования:

Цель работы

•         Анализ предполагаемых природных межвидовых гибридов степного орла и орла могильника молекулярно-генетическими методами.

Задачи

•         Подобрать потенциальные ядерные маркеры межвидовой гибридизации;

•        Определить пол предполагаемых межвидовых гибридов молекулярно-генетическими методами;

•        Установить последовательность выбранных фрагментов ядерного генома у степного орла, орла могильника и предполагаемых природных гибридов;

•        Оценить эффективность выбранных маркеров для выявления природных межвидовых гибридов степного орла и орла могильника.

1. Литературный обзор

1.1 Эволюционные теории и гибридизация

Гибридизация - объединение при образовании новой формы двух геномов, двух наборов хромосом, происходящих от разных видов, символизируется на филогенетической схеме слиянием отдельных не близко родственных генеалогических линий-ветвей. Это создает картину уже не древа, а сети или «мангровой заросли». Полученные от разных предков сходные (гомеологичные) хромосомы из-за неполной гомологии не спариваются, что вызывает расстройство мейоза. Обычное половое размножение становится невозможным, поэтому почти все виды гибридного происхождения клонируются путем партеногенеза, гиногенеза и даже андрогенеза (Grebelnyi, 2000).

Исторически одна из первых догадок о существовании полиплоидии и гибридизации у позвоночных принадлежит шведскому зоологу Г. Свердсону (Svardson, 1945). По его мнению, таким путем могло возникнуть семейство лососевых рыб. Позже это предположение было доказано кариологическими исследованиями и данными электрофореза, полученными в 1970-е годы B.C. Кирпичниковым (Кирпичников, 1979).

Гибридизация видов - широко распространённое в природе явление, способствующее видообразованию.

Ещё Карл Линней в XVIII веке в своём труде «Система природы» говорил:

«<…> исходя из первого растительного начала, было создано столько различных растений, сколько мы имеем растительных порядков. Эти порядки смешались в процессе размножения, так что получилось столько растений, сколько сейчас существует родов. Природа смешала затем все эти формы <…> и из них создала существующие ныне виды».

Линней предположил, что изначально сотворённые виды (первичные), скрещиваясь между собой, могли дать множество вторичных видов. Однако шведский учёный отмечал, что межвидовые гибриды у животных значительно более редки по сравнению с растениями (Боркин, и др., 2013).

Современник Карла Линнея французский натуралист Жорж Бюффон, обсуждая проблему гибридизации у животных, предложил в качестве критерия виды «половой метод»: отсутствие потомства или бесплодность гибридов указывают на принадлежность скрещиваемых родителей к разным видам, а плодовитость гибридов - к одному.

Российский учёный Петр Симон Паллас в конце XVIII века отверг гипотезу Линнея, перечислив «препятствия» для скрещивания между дикими видами (Паллас, 2011):

1)              Непреодолимость инстинкта;

2)            Бесплодие гибридов, их слабость и несовершенство;

3)            Рассеивание видов по различным пределам земного шара (т.е географическая изоляция).

Основатель эволюционной теории Чарльз Дарвин также признавал, что скрещивание разных видов приводит к бесплодным гибридам. Следует отметить, что вся глава «Происхождения видов», посвященная анализу гибридизации, была построена на опытах по скрещиванию растений, тогда как сведения о животных были незначительны (Дарвин, 1991 - перевод 6-го издания).

Межвидовую гибридизацию у растений исследовал и французский ботаник Шарль Нодэн, современник Дарвина. Нодэн полагал, что качественного различия между видами, расами и разновидностями нет. На практике, по его мнению, очень трудно разграничить гибриды (результат скрещивания разных видов) и помеси (результат скрещивания рас и разновидностей). Ш. Нодэн отрицал возможность слияния разных видов в один путём гибридизации (Нодэн, 1935).

Однако уже в начале XX века голландский ботаник Ян Лотси выдвинул концепцию эволюции через гибридизацию видов. Учёный определял вид как группу генетически близких особей. Из этого следовало, что все животные, размножающиеся половым путём, должны рассматриваться как гибриды, поскольку все особи, кроме клонов, генетически гетерогенны, а процесс видообразования неизбежно ассоциируется с гибридизацией (Лотси, 1914).

В первой трети XX века некоторые зоологи также задумались о формообразующей роли гибридизации. Немецкий орнитолог Эрвин Штреземанн в 1919 г. обсуждал возникновение гибридных популяций в зоне вторичного контакта близкородственных видов птиц. Британский орнитолог Перси Р. Лоу в 1929 г. выдвинул концепцию миктогонии (или плетогамии), которая объясняла многообразие некоторых групп птиц на островах, например, вымерших моа Новой Зеландии или галапагосских вьюрков, с помощью гибридизации. Предположение было отвергнуто, но в наши дни оно снова привлекает к себе внимание.

Благодаря развитию молекулярных и цитогенетических методов во второй половине XX века появилась возможность оценивать гибриды не только по морфологическим признакам, но и на генетическом уровне. Последовавшие исследовательские работы показали, насколько широко распространена гибридизация в природе, и заставили по-новому взглянуть на значение гибридизации и на проблему вида в целом.

Становится очевидно, что гибридизация может привести как к образованию новых видов, так и к поглощению одного вида другим (интрогрессия генов). Последнее представляет серьёзную опасность для угрожаемых видов, так как может повлечь за собой их полное исчезновение. Угроза исчезновения особо остра при контакте многочисленного вида с редким (Заславский, 1967). Например, интродукция североамериканской кряквы Anas platyrhynchos в Новую Зеландию привела к гибридизации с местной Anas superciliosa с образованием репродуктивно успешных гибридов и билатеральной интрогрессией, что, по-видимому, приведёт к потере идентичности аборигенной утки как отдельного вида (Rhymer, и др., 1994). Постепенное накопление в смешанной популяции гибридов, вовлекаемых в процессы размножения, приводит к дальнейшему размыванию четких границ между взаимодействующими видами.

Следует отметить, что возможность гибридизации среди живых организмов дала стимул к оформлению во второй половине ХХв концепции ретикулярной, или сетчатой, эволюции (Боркин, и др., 1980). Сторонники этой теории, в противовес дивергентной эволюции по Дарвину, допускают вторичное срастание концов эволюционного древа в результате гибридизации и формирование гибридогенных популяций или видов с новыми свойствами (Боркин и Даревский 1980; Васильев 1985; Даревский 1986, 1995; Гребельный 2008; Васильев и др. 2010).

Среди позвоночных гибридизации особенно подвержены птицы. Предполагаемые гибриды двух представителей этого обширного класса и будут рассмотрены в данной работе.

1.2 Фенотипические последствия гибридизации (примеры у птиц)

В апреле 1964 года в окрестностях посёлка Хасан Приморского края был добыт гибридный самец обыкновенной и чёрной крякв. Кроме того, гибридные самцы и самки наблюдались в Японии и Гонконге (Нечаев, и др., 2010).

Был отмечен случай межвидовой гибридизации у гаичек. В 1979 году на острове Лодейном (вершина Кандалакшского залива Белого моря) было обнаружено гнездо смешанной пары - самка пухляка Parus montanus и самец сероголовой гаички P.сinctus. Впоследствии у пары родился гибридный птенец (Шутова, 2009). Образованию смешанной пары у этих видов гаичек, различающихся по экологии и поведению, вероятно, способствовало островное положение территории, большая мозаичность растительности, частое образование смешанных стай в осенне-зимний период и низкая плотность гнездования.

Е.Н. Панов (Панов, 2001) был свидетелем успешного размножения смешанной пары двух видов овсянок - обыкновенной (Emberiza citrinella) и белошапочной (E.leucocephalos) - в зоне вторичного контакта.

Вполне логично предположить, что в данном случае процесс перемешивания генофондов двух близких видов есть не что иное как функция времени. В пользу этой гипотезы свидетельствуют, прежде всего, изменения, произошедшие за 30 лет в популяции овсянок Новосибирской обл. Похоже, в данном случае мы столкнулись с так называемой поглотительной гибридизацией, которая привела к исчезновению фенотипа белошапочной овсянки и к формированию своеобразной полиморфной популяции. (Панов, 2001).

1.3 Характеристика исследуемых видов

1.3.1 Орёл-могильник

Могильник - крупная птица семейства Ястребиных (лат. Aquila heliaca), имеет тёмно-бурую окраску, белые пятна на лопатках (могут быть не выражены), двуцветный чёрно-серый хвост (рис. 1).

Рисунок 1. Внешний вид орла-могильника

Гнездится в лесостепной и степной зонах Евразии от Венгрии и Балкан до Закавказья, Средней Азии, Монголии, Забайкалья. Зимует на юге умеренной зоны, в субтропиках и тропиках Евразии от Аравии до Китая и в долине Нила. Предпочитает открытые ландшафты, гнездится в лесных балках, рощицах. Гнёзда строит на больших деревьях. Вид редкий, занесён в Красные книги МСОП, России и Казахстана. В России исчисляется несколькими сотнями пар (данные Красной Книги)

1.3.2 Степной орёл

Степной орёл (лат. Aquila nipalensis), хищная птица семейства ястребиных, размером с могильника (рис.2).

Рисунок 2. Внешний вид степного орла

Окраска взрослой птицы однотонно-бурая разных оттенков, молодые птицы буро-охристые со светлым надхвостьем и подхвостьем, белыми каймами по краю и середине крыльев и по краю хвоста. Степной орёл обладает более длинным хвостом, чем могильник. Обитает в полупустынях и пустынях Евразии, ареал смещён на юг и на север по сравнению с могильником, доходит от Прикаспия до Тибета и Маньчжурии. Зимует в тропиках и субтропиках Азии и Африки. Гнездится в сухих целинных степях, горных цепях, последнее время стал селиться в агроландшафтах. Гнездо строит на курганах, степных