Однако, порой с целью нагромождения материала его засевают на жидкие питательные среды.
На второй день (2 этап исследования) на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония- это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах являются проявлением их культуральных свойств.
Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. При потребности исследуют колонии под лупой, малым или большим увеличением микроскопа. Структуру колоний исследуют в проходном свете при малом увеличении микроскопа. Они могут быть гиалинови, зернистые, нитевидные или волокнистые, которые характеризуются наличием переплетенных нитей в толще колоний.
Характеристика колоний - важна составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.
Характеризовать колонии можно за разными признаками. За величиной (диаметром) их разделяют на больших (4-6 мм и больше), средних (2-4 мм), мелких (1-2 мм), карликовых или точечных (меньше 1 мм). Форма колоний может быть самой разнообразной: правильно круглая, неправильная (амебоподибна), ризоидна. Они бывают прозрачными, что пропускают светло, и мутными.
За рельефом и контуром формы в вертикальном разрезе колонии разделяются на плоских, выпуклых, куполообразных, краплеподибни, конусообразные, плоскоопукли, плоские, что стелются по поверхности среды, с вдавленным центром, из припиднятой в виде соска серединой.
Поверхность колоний может быть матовой или блестящей, с глянцем, сухой или влажной, гладкой и блестящей или шершавой. Гладкие и блестящие колонии помечают как S-формы (smooth - гладкий и блестящий), а шершавые - R-формы (rough - шершавый, неравный).
Форма шершавых поверхностей также может быть разнообразной: морщинистой, бородавчатой, шагреневой, иметь радиальную исчерченность и тому подобное.
Подавляющее большинство микроорганизмов образуют бесцветные колонии или мутно молочного цвета. Однако некоторые из них формируют цветные колонии. Их цвет определяется пигментом, который синтезируют бактерии: белые, кремовые, желтые, золотистые, синие, красные и тому подобное.
При доторканни к колонии петлей можно определить ее консистенцию: пастообразная, вязкая или слизистая, сухая, хрупкая и тому подобное.
Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают за методом Грамма для изучения морфологических и тинкториальних свойств возбудителей, исследуют подвижную бактерий в “висячей” или “раздавленой” капле. Эти признаки имеют чрезвычайно большое диагностическое значение при характеристике отдельных видов микроорганизмов.
Остатки исследуемых колоний осторожно, не касаясь других, снимают из поверхности среды и засевают на скошенный агар или на секторы чашки Петри с питательной средой для получения чистой культуры. Пробирки или чашки с посевами помещают в термостат при оптимальной температуре на 18-24 часов.
Сегодня, как правило, бактериологи пытаются пользоваться стандартными сухими питательными средами, которые выпускает микробиологическая промышленность. Такие среды позволяют существенно улучшить результаты микробиологических исследований и стандартизировать их.
На жидких питательных средах бактерии также могут расти по-разному, хотя особенности проявлений роста более бедны, чем на плотных.
Бактерии способны вызывать диффузное помутнение среды, цвет его при этом может не изменяться или приобретает цвет пигмента. Такой характер роста чаще всего наблюдается в большинстве факультативно анаэробных микроорганизмов.
Порой происходит образование осадка на дне пробирки. Он может быть крошкообразным, гомогенным, вязким, слизистым и др. Среда над ним может оставаться прозрачной или становиться мутной. Если микробы пигмента не образуют, осадок имеет сирувато-билий или желтоватый цвет. Подобным чином растут, как правило, анаэробные бактерии.
Пристеночный рост проявляется образованием хлопьев, зерен, прикрепленных к внутренним стенкам пробирки. Среда при этом остается прозрачной.
Аеробные бактерии имеют тенденцию к поверхностному росту. Часто образуется нежная бесцветная или голубоватая пленка в виде едва заметного налета на поверхности, которая исчезает при стряхивании или взбалтывании среды. Пленка может быть влага, толстая, иметь вязанку, слизистую консистенцию и прилипать к петле, тянется за ней. Однако, встречается и плотная, сухая, хрупкая пленка, цвет которой зависит от пигмента, который производится микроорганизмами.
В случае необходимости изготовляется мазок, окрашивается, исследуется под микроскопом, а микроорганизмы засеваются петлей на поверхность плотной питательной среды для получения изолированных колоний.
На третий день (3 этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.
Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крася его за методом Грама, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальних (способность краситься) свойств, делают вывод, что культура чиста. В некоторых случаях уже за внешним видом и особенностями их роста можно сделать вывод о виду выделенных возбудителей. Определение вида бактерий за их морфологическими признаками называется морфологической идентификацией. Определения вида возбудителей за их культуральными признаками называют культуральной идентификацией.
Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виду выделенных микробов. Потому изучают биохимические свойства бактерий. Они достаточно разнообразны.
Чаще всего исследуют сахаролитические, протеолитические, пептолитические, гемолитические свойства, образования ферментов декарбоксилаз, оксидазы, каталазы, плазмокоагулазы, ДНК-азы, фибринолизина, восстановление нитратов в нитритыи тому подобное. Для этого существуют специальные питательные среды, которые засевают микроорганизмами (МПБ, свернутая сыворотка, молоко и др.).
Изучение морфологических и культуральных свойств.
1) Изучение морфологических свойств микроорганизмов.
Изолировав чистую культуру микроорганизма, необходимо определить ее видовую принадлежность. Для этого проводят изучение целого ряда свойств выделенных животных (морфологических, культуральных, биохимических). Для идентификации организмов изучают также антигенные свойства. При установлении вида патогенных бактерий обязательно определяют патогенность на лабораторных животных. Совокупность всех свойств, признаков, особенностей микроорганизмов называют биологическими свойствами.
Морфологические свойства изучают путем микроскопии окрашенных препаратов, приготовленных из исследуемых молодых культур, выделенных на плотных или жидких питательных средах. Молодыми культурами для большинства мезофильных микробов считают 1-2-суточные, выращенные при температуре 37°С, а выращенные культуры при 20°С исследуют не позже 2 суток. При описании морфологических свойств необходимо отметить состав питательной среды, температуру роста микроба и возраст культуры. При этом отмечается форма микробных клеток наличие, характер их расположения, размер, наличие спор (их расположение), капсул, наличие инволюционных форм, а также тинкториальные свойства т.е. способность микроорганизмов окрашиваться анилиновыми красителями и по методу Грама.
При изучении морфологических свойств параллельно определяют и чистоту культуры. Кроме просмотра окрашенных мазков определяют наличие жгутиков путем исследования подвижности микробов в препаратах висячая или раздавленная капля, а также путем посева культуры в полужидкий мясопептонный агар (подвижные бактерии вызывают помутнение агара, а неподвижные растут по линии укола).
Характеристика препарата:
1. Чистота культуры: чистая
2 Форма микробных клеток: кокки
3. Величина бактерий: мелкие
4. Характер расположения: кокки, стафилококки
5. Тинкториальные свойства (окраска по Граму): положительная
6. Наличие спор: нет
2) Изучение культуральных свойств микроорганизмов.
Этот этап представляет собой изучение особенностей их роста на плотных, полужидких и жидких средах при определенных условиях.
Характер роста на плотной питательной среде изучают с подробным описан формы, величины, прозрачности, цвета, поверхности, рельефа, консистенции краев и структуры колоний, образованных на МПА, также изучают характер роста по линии укола при посеве в столбик МПЖ. Бактерии каждого вида формируют колонии с определенными признаками, которые учитывают при идентификации.
Характеристика колонии на плотной среде (МПЖ):
1. Форма колонии: круглая с фестончатым краем
2. Диаметр колонии: 2-3 мм
3. Цвет колонии: бело-желтый
4. Рельеф: плоско-выпуклый
5. Поверхность колонии: гладкая
6. Характер краев: фестончатые, с небольшими неровностями
7. Структура колонии: гомогенная
8. Консистенция: кашеобразная
9. Блеск: присутствует
10. Прозрачность: полупрозрачная
Характеристика в жидкой среде (МПБ):
1. Степень помутнения: слабое
2. Наличие пленки на поверхности: тонкая, нежная
3. Наличие пристеночного кольца: слабо выражено
4. Наличие осадка: хлопьевидный
5. Цвет среды: желтый.
3.Изучение биохимических свойств.
У микроорганизмов разных видов в пределах рода есть общие (родовые) и специфические для отдельных видов ферменты. В связи с тем, что каждый вид микробов характеризуется важнейшим этапом идентификации микроорганизмов.
О наличии того или иного фермента судят по способности микроорганизма воздействовать на известный субстрат. Присутствие фермента выявляют по изменению физического состояния субстрата (разжижению желатина), закислению питательной среды (среды Гисса с углеводами). Образованию определенных продуктов метаболизма (индол, аммиак, сероводород) и т.д.
Ферментативная активность микробов чрезвычайно разнообразна. Она зависит от характера и количества ферментов, которые микробная клетка продуцирует и выделяет во внешнюю среду.
При изучении ферментативной активности микробов наибольшее значение придают определению сахаролитических, протеолитических, липолитических и окислительно-восстановительных ферментов, активирующих соответственно расщепление углеводов, белков липидов и редуцирующих некоторые органические красители.
Выявление сахаролитической активности. Сахаролитическую активность изучают по образованию микроорганизмами экзоферментов карбогидраз (глюкозидаз), по интенсивности образования органических кислот и ароматических веществ. Сахаролитическая способность микробов определяется по ферментативному расщеплению моносахаридов, полисахаридов, многоатомных условно именуемых «сахарами» на альдегиды, органические кислоты и газообразные продукты (углекислый газ, метан, водород). Конечными продуктами их расщепления являются углекислый газ и вода.
Для определения способности микроорганизмов расщеплять сахара используют специальные дифференциально-диагностические среды жидкие, полужидкие и плотные питательные среды. При отсутствии у микробов какого-либо фермента углеводы не расщепляются, индикатор остается в обесцвеченной форме, цвет среды не изменяется. Если под действием ферментов микробов углевод сбраживается, о образуется органическая кислота, которая вступает в реакцию с веществами, обесцвечивающими индикатор (со щелочью или розоловой кислотой) и нейтрализует их. В результате этого происходит восстановление цвета индикатора и окрашивание среды в розово-малиновый (с индикатором Андреде) или голубой (с индикатором «ВР») цвет.
Для выявления сахаролитических ферментов исследуемую культуру засеивают в среду Гисса, которая содержит 5 моноуглеводов: глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу, сахарозу. Сахара и спирты, используемые для сред Гисса, должны быть химически чистыми.
Результат: Цвет среды изменился, значит есть фермент, под действием которого расщепляется углевод - рН среды меняется, а индикатор изменяет сцвет.
Изучение протеолитических свойств микробов
Некоторые микроорганизмы продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты - протеазы, которые расщепляют белки до промежуточных продуктов (пептоны, альбумозы, полипептиды, аминокислоты) или до продуктов конечного распада белка (индол, сероводород, аммиак и др.)