Реферат
На тему: «Методы выделения чистой культуры микроорганизмов»
Выполнила:
студентка 2 курса
группы В-21.2
Бойко Диана
Проверила:
Воложанинова Н.В.
Симферополь - 2016
Содержание
Бактериологическое исследование
Техника посевов микроорганизмов
Этапы выделения чистых культур микроорганизмов
Изучение морфологических и культуральных свойств
Изучение протеолитических свойств микробов
Определение видов бактерий
Список использованной литературы
Бактериологическое исследование
бактериологический микроорганизм посев морфологический
Бактериологический метод исследования является важнейшим в практической деятельности любой микробиологической лаборатории. От правильного его выполнения зависит определение этиологического фактора, который вызывал заболевание, и, соответственно, выбор тактики лечения инфекционного больного. Важность этого метода объясняется тем, что во многих случаях врачи имеют дело с микробными ассоциациями, тогда необходимо устанавливать роль каждого из микробов в возникновении болезни.
Потому перед освоением основных принципов и методов выделения чистых культур необходимо овладеть техникой посевов и пересеваний бактерий в жидких и на плотные питательные среды.
Техника посевов микроорганизмов
Посевы проводят как с целью выделение возбудителей из исследуемого материала от больных, так и для нагромождения чистых культур с целью последующего их изучения и идентификации. Техника посевов в жидких и на плотные питательные среды имеет свои особенности.
В левую руку берут две пробирки. В одной находится питательная среда (плотное или жидкое), в другой - исследуемый материал. Пробирки зажимают большим и указательным пальцами. Для того, чтобы можно было наблюдать за содержанием пробирок, их держат сверху кисти руки. Пробирки должны быть кое-что наклоненными, и нужно следить, чтобы при открытии их материал или посторонние микробы зповитря и окружающих предметов из одной не попали в другую. Пробки из пробирок вынимают, держа их 4 и 5 пальцами правой руки. Тремя другими пальцами правой руки, как карандаш, держат бактериологическую петлю или пипетку, которыми распределяют исследуемый материал.
Сначала стерилизуют петлю в верхней части пламени газовой горелки. Пробирки открывают и край их проносят через пламя горелки. Петлю опускают в пробирку, где есть исследуемый материал, и, осторожно касаясь стенки, охлаждают. В последующем петлю опускают в пробирку и набирают материал. Если он находится в жидком состоянии, для посева достаточно капли жидкости, которая задерживается в кильке бактериологической петли. Когда используют микробов, которые выросли на поверхности среды, осторожно плавным движением набирают небольшое количество их, следя, чтобы не повредить питательную среду. Петлю медленно вынимают из пробирки, не касаясь ее стенок, и переносят в другую пробирку со средой. Штриховыми движениями от одной стенки пробирки к другой, начиная с нижней части среды, проводят занял материалу по скошенной поверхности агара снизу кверху.
Петлю вынимают из пробирки, пробки и края пробирок проносят через пламя и закрывают. Петлю прожаривают в пламени, чтобы уничтожить микроорганизмы.
При посеве материала на жидкую питательную среду петлю с материалом окунают в жидкость. Если он не снимается из петли, его осторожно растирают на стенке пробирки и омывают средой.
Материал, который набирали пастеровской или градуированной пипеткой, выливают в питательную среду, а для равномерного распространения его пробирку осторожно, чтобы не замочить пробку, стряхивают или вращают, зажав в ладонях.
Для посева материала на плотную питательную среду в чашках Петри небольшое количество материала набирают стерильной петлей и втирают в поверхность среды возле края чашки.
После этого петлю стерилизуют в пламени, чтобы уничтожить избыток материала, охлаждают. Следующий этап посева начинают с места, где закончился предыдущий. Петлю кладут горизонтально на поверхность агара, где было сделано занял, проводят один-два разы по поверхности и делают занял по остальным среды. Необходимо пытаться, чтобы штрихи посева длились от края к краю чашки, не повреждали поверхности агара и располагались близко друг к другу. Этим искусственно продлевается линия посева и создаются возможности для получения изолированных колоний.
Посев шпателем и тампоном в чашки Петри
Материал предварительно наносят на поверхность питательной среды возле края чашки петлей или пипеткой. Стерильный шпатель проносят через пламя, охлаждают, касаясь стенки чашки. Осторожными круговыми движениями, держа чашку полузакрытой, распределяют материал равномерно по поверхности среды.
Посев шпателем
При посеве тампоном чашку кое-как открывают одной рукой, тампоном касаются поверхности агара возле края чашки и начинают проводить движения штрихами от края к краю чашки, втирая осторожно материал в поверхность среды, не повреждая его, постепенно вращая тампон. После проведения посева чашку вращают на 90°и повторяют перпендикулярно к предыдущему.
При посеве уколом в столбик питательной среды пробирку с мясо-пептонним агаром, желатином и т. д.берут в левую руку, петлю с материалом - в правую и делают укол к дну пробирки в среду. Петлю осторожно вынимают, а пробирку закрывают.
Посев материала в толщу питательной среды. Перед посевом, материал должен быть в жидком состоянии. Стерильной градуированной пипеткой набирают 0, 1, 0, 5 или 1, 0 мл материалу и выливают его в стерильные чашки Петри. После этого материал заливают 15-20 мл растопленного и охлажденного до 45-50 °С МПА. Осторожно покачивая чашку, круговыми движениями по поверхности стола перемешивают в ней материал, достигая его равномерного деления в среде. Чашку оставляют закрытой к полному застудневанию агара, а затем переворачивают вверх дном.
Для того, чтобы выделить чистую культуру микроорганизмов, следует отделить многочисленные бактерии, которые находятся в материале, одна от другой. Это можно достичь с помощью методов, которые основаны на двух принципах - механическом и биологическом разобщении бактерий.
Выделение чистых культур микроорганизмов
Выделение отдельных видов микроорганизмов и получение чистой культуры является основой всей бактериологической работы. Чистой культурой микроорганизма называют популяцию, состоящую из особей одного вида. При выделении чистых культур из исследуемого материала, содержащего смесь микробов, используют методы, подразделяющиеся на две основные группы:
1. Методы, основанные на принципе механического разделения микробов.
2. Методы, основанные на биологических особенностях самих микроорганизмов.
Методы механического разделения микроорганизмов (методы разбавления).
1) Метод Пастера. Из исследуемого посевного материала делается ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде: капля посевного материала вносится в колбу или пробирку со стерильным МПБ, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так до 8-10 колб или пробирок, которые термостатируют при оптимальной температуре. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться. В жидких средах микроорганизмы растут диффузно, т.е. легко распространяются по всей толще среды, что не всегда обеспечивает получение чистой культуры. В настоящее время этот метод не применяется, а используется только для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед его посевом на плотную питательную среду.
2) Метод Коха. 3-4 пробирки с МПЖ расплавляют в водяной бане при 40-45°С. Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленным МПЖ, равномерно размешивают его, вращая пробирку между ладонями, каплю разведенного материала из первой пробирки переносят во вторую, из второй в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки выливают в стерильные чашки Петри. МПЖ должен равномерно покрыть дно чашки. После того как желатин застынет, чашки ставят, чашки ставят крышкой вверх в термостат при температуре 20-22°С. Вместо МПЖ в настоящее время используют МПА. Каждая попавшая в желатин или агар микробная клетка размножается только в том месте, куда была внесена вначале, и образует видимое невооруженным глазом скопление микроорганизмов - колонию, которую отсеивают на МПБ или скошенный МПА для получения чистой культуры.
3) Метод Дригальского (метод фракционного посева). Этот метод основан на механическом разобщении микробных клеток друг от друга на поверхности плотной питательной среды. Каждая микробная клетка, фиксируясь в том месте, куда она попала, начнет размножаться и через 1-2 дня образует колонию. Используют несколько чашек Петри (чаще 3) с залитой в них плотной питательной средой (МПА). На поверхность застывшей среды в первую чашку вносят каплю исследуемого материала, содержащего микроорганизмы. Затем с помощью стеклянного шпателя бактериологической петли каплю растирают по всей поверхности агара после чего этим же шпателем (не обжигая его) проводят по поверхности среды во второй и в третьей чашках. В процессе растирания микробные клетки разъединяются друг от друга. После посева на крышках чашек делают надпись: наименование исследуемого материала или номер анализа посева и номер чашки, фамилия студента Из изолированных колоний выделяют чистую культуру.
4) Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материал через специальные мелкопористые фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержащихся микроорганизмов по величине. Этот метод применяется, главным образом, для очистки вирусов от бактерий.
Методы выделения культур, основанные на биологических особенностях микроорганизмов.
1) Метод нагревания исследуемого материала. Применяется для выделения чистых культур споровых форм микробов (гнилостных, масляно-кислых бактерий и др.). Перед посевом исследуемый материал прогревают на водяной бане при температуре 75-85°С в течение 20-30 мин. Вегетативные клетки погибают, а споры микробов остаются живыми и при последующих высевах на плотную питательную среду прорастают, образуя колонии.
2) Метод Шукевича заключается в точкообразном посеве исследуемого материала в конденсационную воду скошенного агара (у основания скоса). При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются на агар. Для получения чистой культуры производят отсев выросших микробов из верхней части пробирки. Метод используется для выделения очень подвижной палочки Proteus vulgaris.
3) Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ используется для изоляции микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам. Некоторые химические вещества (красители, кислоты и антибиотики) угнетают одни и не оказывают влияния на рост других микроорганизмов. Так небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микробов и не влияют на развитие грамотрицательных; 5-10 % растворы кислот (серной, хлористоводородной) и щелочей быстро убивают большинство микроорганизмов, а микобактерии туберкулеза выживают в растворах такой концентрации и после посева на питательные среды дают рост.
4) Метод обогащения применяют для выделения чистых культур различных микроорганизмов (например, сальмонелл). Для этого производят посев исследуемого материала на питательные среды, способствующие росту определенного микроба. Такие среды называются элективными, например среды Кауфмана, Мюлера для выделения сальмонелл из сильно загрязненного материала. В состав этих сред входят химические вещества, подавляющие рост посторонней микрофлоры и не препятствующие росту сальмонелл. Для молочнокислых бактерий средой обогащения является обезжиренное молоко, развиваясь в котором они образуют молочную кислоту, подавляющие посторонние микроорганизмы.
5) Биологический метод выделения чистой культуры применяется для изоляции патогенных микроорганизмов из исследуемого материала, загрязненного большим количеством сапрофитных бактерий. Предполагая в исследуемом материале наличие определенного возбудителя, заражают этим материалом (вводят внутримышечно, подкожно или внутрибрюшинно) лабораторное животное, которое наиболее восприимчиво к данному виду патогенного микроба. Для выделения возбудителя сибирский язвы и стафилококки чаще используют белых мышей; лептоспироза - золотистых хомяков; анаэробных инфекции-кроликов. Если в исследуемом материале содержится подозреваемый возбудитель, то лабораторное животное заболевает и погибает. Труп павшего животного вскрывают и, соблюдая требования асептики, производят посевы из внутренних органов на питательные среды, где вырастает чистая культура только патогенного микроба, так как клетки сапрофитных микроорганизмов, находящиеся вместе с ним, отмирают в организме лабораторного животного под влиянием его защитных факторов (антител, фагоцитов).
Этапы выделения чистых культур микроорганизмов
Выделение чистой культуры аеробних микроорганизмов состоит из ряда этапов.
В первый день (1 этап исследования) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Его изучают за внешним видом, консистенцией, цветом, запахом и другим признаками, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. В некоторых случаях (острая гонорея, чума) на этом этапе можно поставить предыдущий диагноз, а кроме того, подобрать среды, на которые будет засеваться материал. Занял проводят бактериологической петлей (применяется чаще всего), с помощью шпателя за методом Дригальского, ватно-марлевым тампоном. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18-48 год. Цель этапа - получить изолированные колонии микроорганизмов.