Автореферат: Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита

Таблица 7. Концентрация цитокинов в сыворотках крови мышей после и/п введения 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, Эк-328 и варианта М (пкг/мл)

штамм ЭК-328

вариант М

Примечание: концентрация ИЛ в контрольных сыворотках крови (К), полученных от животных после введения среды 199 на растворе Эрла (пкг/мл): ФНО- - 233; ИЛ-10 - 84; -ИФН - 25±2; ИЛ-12 - 131±56; ИЛ-6 - 16±1; ИЛ-2 - 103. 1 - указаны данные для заболевших животных; у мышей без клинических проявлений болезни содержание ИЛ в указанный срок было К.

При инаппарантной инфекции, вызванной вариантом М, на 7 сутки после заражения мы наблюдали присутствие в крови в небольших концентрациях ИЛ-2, ИЛ-6 и -ИФН. При этом все животные были клинически здоровы, вирус из головного мозга не выделялся, и патоморфологическое исследование ЦНС не выявило каких-либо изменений. Наличие в крови ИЛ-2, ИЛ-6 и -ИФН свидетельствует о развитии к 7-м суткам после заражения сбалансированного (Th1 и Th2) иммунного ответа при данном типе инфекции.

Таким образом, инаппарантная форма КЭ, вызванная вариантом М, характеризуется развитием более раннего неспецифического иммунного ответа и развитием сбалансированного специфического иммунного ответа. Острая форма КЭ, вызванная штаммами Абсеттаров и ЭК-328, характеризуется более поздней активацией неспецифического иммунитета и преобладанием выраженного гуморального ответа, которого оказывается недостаточно для предотвращения развития заболевания.

Поведение популяции ВКЭ при смене хозяина.

Как было показано в табл. 1, адаптированный к клещам вариант М образовывал мелкие (<1 мм) бляшки в культуре клеток СПЭВ, при чем на 100 мелких бляшек практически всегда можно было обнаружить 1-2 крупные бляшки. Из популяции варианта М были клонированы крупная и мелкие бляшки (табл. 8) в культуру клеток СПЭВ. После первого же пассажа клоны, которые были взяты при клонировании как мелкая бляшка, приобретали крупнобляшечный или смешанный фенотип. При следующем пассаже в культуре клеток вирус, образующий крупные бляшки, вытеснял мелкобляшечный вариант. Для устранения примеси мелкобляшечного вируса были сделаны дополнительные клонирования. При клонировании отбирали крупные бляшки. Только после 3 клонирований точечные бляшки при титровании перестали появляться. Новые клоны 160/57, 118/58, и 103/84 образовывали в культуре клеток СПЭВ бляшки, похожие на бляшки родительского штамма ЭК-328, которые к 8 дню достигали размера 6-8 мм и продолжали расти в течение всeго периода наблюдения. Клон 116/59 образовывал бляшки диаметром 4-5 мм. В параллельных экспериментах было предпринято клонирование для получения мелкобляшечного вируса. Только в результате четырех клонирований мелких бляшек были получены клоны 424 и 298, которые практически не содержали в популяции крупнобляшечных вариантов.

Оценка свойств вирионов клонов, полученных из популяции варианта М клонированием методом бляшек, показала, что крупнобляшечные клоны восстановили свойства родительского штамма ЭК-328, а мелкобляшечные клоны сохранили характеристики варианта М.

Таблица 8. Характеристика клонов, выделенных из популяции варианта М в культуре клеток СПЭВ

* - в скобках указано соотношение бляшек разного размера; тчк - точечного размера, т.е. <1мм.

Вирионы клонов 160/57, 118/58, 103/84 и 116/59 обладали ГА, а также образовывали преципитат с АТ в РИЭФ, направленный к катоду (рис. 7). Клоны 424 и 298, подобно варианту М, не обладали ГА и в РИЭФ не образовывали подобной ракеты.

катод

Рисунок 8. Анализ с помощью РИЭФ антигенных структур ВКЭ, накапливающихся в КЖ клеток СПЭВ, инфицированных клонами из популяции варианта М. 1 - клон 118/58, 2 - клон 116/59, 3 - клон 103/84, 4 - клон 160/57, 5 - клон 298

Для клонов, полученных из популяции варианта М и прошедших 3-4 пассажа в культуре клеток СПЭВ, была определена нуклеотидная последовательность генов белка Е, а также фрагментов РНК, включающих позиции, где были выявлены различия между штаммом ЭК-328 и вариантом М. Мелкобляшечный клон 298 сохранил аминокислотные остатки в белке Е, характерные для варианта М (табл.9). Все крупнобляшечные клоны имели треонин в позиции 426, как у штамма Эк-328. Следовательно, эта позиция имеет прямое отношение к реверсии свойств полученных нами клонов.

Таблица 9. Фенотипические и генетические свойства клонов, выделенных из популяции варианта М

н/о - не оценивали; прописные буквы - аминокислоты, строчные - нуклеотиды

Фенотип: Э - размер бляшек, свойства вирионов, как у штамма ЭК-328; М - размер бляшек, свойства вирионов, как у варианта М

Как говорилось выше, замена в позиции 122 у варианта М приводит к повышению положительного заряда белка Е. У клона 118/58, который, как и штамм Эк-328, образовывал крупные бляшки в культуре клеток СПЭВ и давал преципитат с АТ в РИЭФ, мы наблюдали обратную замену глицина на глютаминовую кислоту. У трех клонов 160/57, 116/59 и 103/84, также обладающих фенотипом штамма ЭК-328, в позиции 122 сохранялся глицин, как у варианта М. Тем не менее, у клона 160/57 появлялась замена лизина на глутаминовую кислоту в позиции 124. У клона 116/59 в той же позиции лизин заменялся на глутамин, а у клона 103/84 аналогичная замена лизина на глутамин появлялась в позиции 64. Эти замены приводят к снижению положительного заряда. Как видно на рис. 3, у крупнобляшечных клонов способность связываться с ГС была даже несколько ниже, чем у штамма ЭК-328. Это свидетельствует о том, что замены в позициях 124 и 64 являются компенсирующими. У всех клонов нуклеотиды в позициях 2190 и 2362 совпадали с таковыми у варианта М, т.е. эти клоны являются истинными ревертантами. Вне зависимости от фенотипа все клоны, полученные из варианта М, имели те же аминокислотные остатки в сигнальной последовательности PrM и в белках NS2a и NS4a, что и вариант М, т.е. эти замены, по-видимому, не имеют прямого отношения к описанному фенотипу. Представленные данные не позволяют сделать однозначного заключения о роли замены в позиции 19 в 5'-НTO в изменении характеристик варианта М, но очевидно, что эта замены не могут определять свойства вирионов этого вируса.

Таким образом, при репродукции варианта М в культуре клеток СПЭВ образуется большой спектр ревертантов с различными компенсирующими заменами. Анализ ревертантов, полученных при выделении клонов из популяции варианта М, показал, что характерный для адаптированного к клещам варианта М фенотип определяется двумя заменами в белке Е в позициях 122 и 426, а также определенную роль может играть замена в позиции 19 5'-НТО.

Для клонов 160/57, 118/58, 116/59, и 103/84 провели оценку нейровирулентности и НИ для мышей линии BALB/c разного возраста (табл. 10). Клоны 118/58 и 116/59 восстановили НИ, однако у клонов 160/57 и 103/84 НИ осталась низкой. Клоны 160/57 и 116/59 имеют разные компенсирующие замены в позиции 124, клон 118/58 является обратным ревертантом, а клон 103/84 имеет компенсирующую замену, как клон 116/59, но в позиции 64. При этом, а.к. замены в других позициях у всех этих клонов одинаковы. Таким образом, отличия в НИ клонов варианта М, обладающих всеми другими фенотипическими признаками, свойственными родительскому штамму ЭК-328, могут быть связаны с конкретной аминокислотной заменой и ее позицией в белке Е, хотя также нельзя полностью исключить связь с заменами в других не изученных нами областях генома. Представленные данные позволяют предположить, что вирулентность вируса может определяться аффинностью связывания вирионов с рецепторами на каких-то определенных клетках, и компенсирующие замены модулируют взаимодействие с этими рецептороми.

Способность высоковирулентных вирусов персистировать в ЦНС была проверена на одном из клонов из популяции варианта М, восстановившим свою НИ. При и/п заражении мышей сублетальной дозой клона 116/59 3 мыши не заболели, а у 2 мышей развились параличи. На 6 неделе они полностью выздоровели. У всех животных, не заболевших и выздоровевших, на фоне иммунодепрессии, вызванной введением ЦФ, развития заболевания не наблюдалось, и инфекционный вирус в мозге не выявлялся. При проверке методом ОТ-ПЦР оказалось, что у всех мышей в мозге присутствует вирусная РНК. Таким образом, учитывая отсутствие клинических признаков заболевания и отдаленные сроки после начала инфекции, можно утверждать, что клон 116/59 в сублетальной дозе вызвал у них персистентную инфекцию.

Таблица 10. Вирулентность клонов варианта М для мышей линии BALB/c разного возраста

Таким образом, мы показали, что варианты ВКЭ, обладающие повышенной аффинностью связывания с ГАГ, а также варианты, ревертировавшие по этому свойству как за счет обратной, так и за счет различных компенсирующих замен, могут вызывать все типы инфекций: инаппарантную, острую и персистентную.

Было изучено поведение популяции варианта М в пассажах in vitro и in vivo. Для оценки стабильности популяции варианта М при пассажах в культуре клеток СПЭВ была выбрана схема, предусматривающая пассирование вируса в двух режимах: три независимых линии вели таким образом, что КЖ инфицированных клеток брали для следующего пассажа до наступления ЦПД (24-36 ч после начала инфекции), а 3 линии - после наступления ЦПД (48-72 ч). Для всех линий пассажей 2 раза материал был заморожен между пассированием. Таким образом, было сделано 12 пассажей линий с ЦПД и 20 пассажей для линий без ЦПД. Полученные вирусы были оттитрованы методов бляшек.