Автореферат: Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита

* доза заражения 5,5 lg ЛД50; ** доза заражения 10 ЛД50; *** - период наблюдения

Для характеристики инфекции мыши линии Balb/c 12г были инокулированы и/п 1000 БОЕ данными вирусами. Ежедневно у 3-х мышей брали кровь и органы, содержание инфекционного вируса в которых определяли методом бляшек. На 7-8 день по три мыши для каждого вируса были использованы для патоморфологического исследования.

У мышей, инфицированных штаммом Абсеттаров, после и/п введения 1000 БОЕ инфекция протекала остро. Все животные заболели на 6-7 сутки и к 9 дню погибли. Гистологическое исследование выявило характерную для ВКЭ картину менингоэнцефалита. У животных наблюдали двухволновую виремию с более выраженным вторым пиком (табл. 5). В мозгу вирус появлялся, начиная с 5 суток.

Таблица 5. Динамика появления инфекционного вируса (lgБОЕ/мл 10% суспензии) в крови органах и противовирусных АТ (ИФА) в сыворотках мышей после и/п введения 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, Эк-328 и варианта М

* для титрования использовали сгустки крови; ** популяция вируса была представлена характерными для варианта М точечными бляшками и бляшками с диаметром 5-6 мм, соотношение 1:1. 0 - титр вируса < 1,4 lgБОЕ/мл, титр АТ менее 1:8

При инфицировании мышей 1000 БОЕ штамма Эк-328 наблюдали также острую инфекцию с двухволновой виремией с более выраженным первым пиком. В мозге мышей вирус появлялся на сутки раньше, чем при инфекции вызванной штаммом Абсеттаров, однако животные заболевали только на 8-9 сутки, погибая к 11 дню. При гистологическом исследовании был обнаружен менингоэнцефалит.

Введение 1000 БОЕ варианта М и/п не вызвало никаких признаков заболевания у 49 из 50 зараженных животных. Гистологический анализ не обнаружил каких-либо специфических повреждений в ЦНС инфицированных животных. Нам не удалось выявить инфекционный вирус в крови мышей, инфицированных вариантом М, в лимфоузлах и селезенках был найден вирус в невысоких титрах. У одной мыши из 50 на 7 сутки после начала инфекции наблюдали типичную для КЭ картину заболевания.

Сыворотки мышей, инфицированных штаммами Абсеттаров, Эк-328 и вариантом М были проверены на наличие противовирусных антител с помощью ИФА. При острой инфекции в сыворотках мышей, инфицированных шт. Абсеттаров и Эк-328, противовирусные АТ появлялись на 4 сутки после начала инфекции (табл. 5). При инаппарантной инфекции, вызванной вариантом М, нам не удалось с помощью ИФА выявить противовирусные АТ.

Сыворотки мышей, инфицированных штаммом Абсеттаров и вариантом М, полученные на 6 сутки после заражения, были проанализированы с помощью РИП вирусных белков из лизатов инфицированных клеток. Сыворотка мышей, зараженных штаммом Абсеттаров, преципитировала белок Е и высокомолекулярные неструктурные белки NS1, NS3 и NS5 из лизатов клеток СПЭВ, инфицированных как штаммом Абсеттаров, так и вариантом М. С помощью сыворотки мышей, зараженных вариантом М, никакие вирусные белки выявлены не были. С помощью лизата клеток СПЭВ, инфицированных дефектным аденовирусом Rad51, несущим ген белка NS1 вируса КЭ (Timofeev et al., 1998), мы выявили в небольших количествах АТ к белку NS1 в сыворотках мышей, инфицированных вариантом М, взятых на 7 и 28 дни инфекции.

Через 3 недели и 5 месяцев после и/п введения 1000 БОЕ варианта М мыши были умерщвлены, у них были взяты головной мозг, селезенки, лимфоузлы, а также были получены сгустки крови. Ни в исходных гомогенатах органов, ни в материалах после двух слепых пассажей этих гомогенатов в культуре клеток СПЭВ инфекционный вирус не был обнаружен. На эти сроки в мозге и селезенках мышей, инфицированных вариантом М, на фоне введения циклофосфана не удалось выявить вирусную РНК с помощью предложенного нами варианта ОТ-ПЦР с внутренним контролем (Романова и др., 2006).

В те же сроки через 3 недели и через 5 месяцев после и/п введения 1000 БОЕ варианта М мыши были разрешены 100 ЛД50 штамма Абсеттаров. Все мыши, предварительно инфицированные вариантом М, были защищены от последующего введения вирулентного вируса КЭ. Формирование длительного протективного иммунитета после и/п введения варианта М было показано в трех независимых экспериментах.

Отсутствие клинических признаков заболевания и повреждений в ЦНС показывают, что вариант М при и/п введении мышам вызывает инаппарантную форму инфекции, характеризующуюся отсутствием вируса в крови и ЦНС, хотя чувствительность использованного метода (45 БОЕ в пробе) не позволяет полностью исключить попадание небольшого количества вируса и его персистенции в ЦНС.

Для ГАГ-связывающих мутантов переносимых комарами флавивирусов ЯЭ и ЭДМ было показано, что после внутривенного введения вируса они быстро попадают в печень, где, по-видимому, элиминируются макрофагами печени (Lee and Lobigs, 2003). Вирионы могут попадать в печень в свободном состоянии или связанными с клетками крови. Мы проверили сорбцию вирионов изучаемых вирусов на эритроцитах мыши. Для этого у здоровых мышей были взяты эритроциты, к эритроцитам были добавлены вирусы. После инкубации несвязавшийся с клетками вирус был собран, и были определены титры свободного и связанного с эритроцитами вируса. На рис. 5А представлена динамика сорбции вирионов родительского штаммов Абсеттаров, ЭК-328, и варианта М на эритроцитах мыши. Насыщение эритроцитов вирионами происходит в первые 10 мин после добавления вируса. На рис. 5Б показана доля связанного вируса при разных соотношениях эритроцитов и вирионов. В любых условиях доля вирионов варианта М, связанных с эритроцитами, в 50-100 раз больше, чем этот показатель для штаммов Эк-328 и Абсеттаров.

Для оценки активации раннего неспецифического противовирусного иммунного ответа проводили определение содержания /-ИФН, ФНО-, ИЛ-10 и ИЛ-12 в крови мышей на начальных этапах инфекции после и/п введения 1000 БОЕ вирусов в виде вируссодержащей мозговой суспензии или КЖ инфицирпованных клеток СПЭВ.

Содержание /-ИФН в сыворотках крови, взятых от трех мышей через разные сроки после начала инфекции, определяли по подавлению цитопатического действия (ЦПД) вируса энцефаломиокардита мышей (ЭММ) (Бабаянц и др., 1985). В качестве контроля использовали сыворотку от трех мышей, которым вместо вируса вводили мозговую суспензию (МС) от здоровых мышей в соответствующем разведении. В сыворотке крови контрольных мышей через 5 часов после введения МС от здоровых мышей обнаружили /-ИФН в титрах 1:8, который отсутствовал в пробе, взятой через следующие 5 часов. Как представлено на рис. 6, штамм ЭК-328 оказался слабым индуктором ИФН 1 типа.

Рис. 5. Характеристика адсорбции штаммов Абсеттаров, Эк-328 и варианта М на эритроцитах мыши

Штамм Абсеттаров и вариант М индуцировали /-ИФН в сопоставимых титрах, но при инфекции, вызванной вариантом М, ИФН появлялся в крови животных уже через 5 часов, а у мышей, зараженных штаммом Абсеттаров, только через 10 часов после введения вируса.

Уровень остальных ключевых цитокинов в сыворотках крови животных, зараженных и/п 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, ЭК-328 и варианта М в виде КЖ инфицированных клеток СПЭВ, устанавливали с помощью коммерческих наборов для определения соответствующих цитокинов методом ИФА. Количество цитокинов в сыворотках крови инфицированных мышей сравнивали с уровнем цитокинов в контрольных сыворотках, полученных от животных, которым и/п была введена питательная среда 199.

Рис. 6. Динамика появления ИФН-1типа в сыворотках мышей, и/п инфицированных штаммами Абсеттаров, Эк-328 и вариантом М в дозе 1000БОЕ

В первые часы после заражения животных изучаемыми штаммами ВКЭ мы наблюдали повышение в крови уровня ФНО- и ИЛ-10. ФНО- является провоспалительным цитокином (табл. 6). Его появление в крови свидетельствует об активации макрофагов и нейтрофилов. ФНО- индуцирует синтез ИЛ-10, а ИЛ-10 в свою очередь, подавляет синтез ФНО- (van der Pool et al., 1994). В нашем эксперименте ИЛ-10 выявляли одновременно с ФНО-, после чего концентрация ФНО- в крови животных понижалась до уровня контроля. Известно, что ИЛ-10, являясь регулятором иммунных реакций, подавляет продукцию таких основных провоспалительных цитокинов, как ИЛ-6, ФНО-, экспрессию на клеточной мембране МНС-II и антигенпрезентирующую способность моноцитов/макрофагов, продукцию цитокинов Тh-1 лимфоцитами (-ИФН, ИЛ-2), продукцию цитокинов натуральными киллерами (НК), пролиферацию Т-лимфоцитов (Кашкин, 1998). Таким образом, ВКЭ, попадая в организм мыши, индуцирует состояние иммунодепрессии у инфицированных животных в первые часы после заражения, при этом штаммы ВКЭ могут различаться по выраженности и длительности вызываемой ими иммунодепресии.

В отличие от штамма Абсеттаров через 10 часов после заражения штаммом ЭК-328 и вариантом М в крови мышей в высоких концентрациях выявляли ИЛ-12, который на ранних стадиях инфекции свидетельствует об активации антигенпрезентирующих и фагоцитирующих клеток (Хаитов и Пинегин, 2000; Biron & Sen, 2002). Появление в крови этого интерлейкина и /-ИФН может приводить к активации НК.

Таблица 6. Концентрация цитокинов в сыворотках крови мышей на ранних этапах инфекции после и/п введения 1000 БОЕ шт. Абсеттаров, ЭК-328 и варианта М (пкг/мл)

Примечание: концентрация ИЛ в контрольных сыворотках крови (К), полученных от животных после введения среды 199 на растворе Эрла (пкг/мл): ФНО- - 23±3; ИЛ-10 - 8±4; ИЛ-12 - 131±56

На 4-е сутки у животных, зараженных штаммом Абсеттаров, в сыворотках крови обнаруживали ИЛ-6 и незначительное количество -ИФН (табл. 7). У животных, зараженных шт. ЭК-328, ИЛ-6 и -ИФН появились на сутки раньше. Повышение концентрации ИЛ-6 свидетельствует об активации Th2-лимфоцитов, которые обеспечивают формирование гуморального иммунного ответа. Об этом свидетельствует и появление в это время противовирусных антител в сыворотках крови мышей, инфицированных штаммами Абсеттаров и Эк-328. Продукция -ИФН связана с активностью ИЛ-12. При инфекции штаммом Абсеттаров мы наблюдали однократный подъем уровня ИЛ-12 на 2 сутки, а при инфекции шт. ЭК-328 - двукратный подъем через 10 часов и на 4 сутки после заражения животных. При этом второе повышение количества ИЛ-12 в крови мышей, инфицированных штаммом ЭК-328, не сопровождалось последующей продукцией -ИФН.

При инфекции вариантом М на 3 сутки в крови животных повысился уровень ИЛ-2 и -ИФН. Это говорит об активации Th1-лимфоцитов, которые обеспечивают развитие клеточного иммунитета. -ИФН в крови животных далее выявлялся на протяжении всего срока наблюдения.

На 7 сутки после заражения в крови мышей, инфицированных штаммом Абсеттаров, обнаружили в высоких титрах ИЛ-10, -ИФН, ИЛ-6 и ФНО-. В эти же сроки отмечали выраженные симптомы заболевания, высокий титр инфекционного вируса в крови и мозге, развитие менингоэнцефалита. Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови животных, заболевших на 7-е сутки после и/п введения 1000 БОЕ штамма ЭК-328, также был высоким. Появление провоспалительных цитокинов в крови инфицированных животных в высоких титрах на этой стадии острого заболевания КЭ свидетельствует о выраженном патологическом процессе в ЦНС и нарушении гематоэнцефалического барьера.