Автореферат: Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита

Во всех линиях количество крупных бляшек увеличилось уже на первых пассажах до 7-10% и при дальнейшем пассировании колебалось от пассажа к пассажу, но оставалось на данном уровне. Во всех 6 линиях вирус не приобрел способности формировать направленный к катоду преципитат вирионов с АТ в РИЭФ. Для одной из линий, пассированной без выраженного ЦПД, была определена нуклеотидная последовательность в областях генома, где были найдены замены между штаммом ЭК-328 и вариантом М. Только в позиции в 5'НТО у пассированного в культуре клеток СПЭВ вируса наблюдали реверсию к штамму ЭК-328. НИ этого вируса повысилась до 600 БОЕ/ЛД50, однако не достигла уровня, свойственного штамму ЭК-328.

Полученные данные показывают, что в отличие от заражении с низкой множественностью, когда вирус клонировали из бляшки, при пассажах адаптированного к клещам варианта М в культуре клеток СПЭВ без выраженного эффекта "бутылочного горлышка" формируется стабильная гетерогенная популяция с содержанием 7-10% крупнобляшечного варианта.

При пассировании варианта М через мозг юных мышей наблюдали постепенное нарастание количества крупных бляшек. К 12 пассажу соотношение крупных и мелких бляшек было 1:1. Полученный вирус был назван RNm. Вирионы этого вируса нерегулярно образовывали катодный преципитат с АТ в РИЭФ. Секвенирование фрагмента РНК варианта RNm, кодирующего белок Е, показало, что он сохранил нуклеотидную последовательность варианта М (табл.10). Тогда из популяции варианта RNm были выделены 2 крупнобляшечных клона 46 и 48. Вирионы всех клонов вели себя в РИЭФ, как вирионы штамма ЭК-328. При секвенировании генов Е этих клонов было установлено, что все они имели нуклеотидную последовательность, аналогичную таковой родительского штамма ЭК-328, включая нуклеотиды в позициях 2190 и 2362, по которым вариант М отличается от родительского штамма Эк-328. У этих клонов и в позиции 9888 был уридин, как у штамма Эк-328. Аминокислотные замены могут иметь адаптивный характер и ревертировать при изменении селективного воздействия, однако, реверсия трех н.т. замен в разных частях генома крайне маловероятна, и их можно использовать в качестве маркера, позволяющего различить вариант М и штамм ЭК-328. Таким образом, крупнобляшечные клоны, выделенные из популяции варианта М, переадаптированного к мозгу белых мышей, оказались примесью родительского штамма ЭК-328, сохранившейся в популяции варианта М в процессе 17 пассажей через клещей. Это показывает, что ВКЭ может существовать в виде гетерогенной популяции не только при репродукции в клетках млекопитающих, но и в клещах.

В одном из экспериментов взрослые мыши линии BALB/c были и/п инфицированы 10000 БОЕ варианта М. Несколько мышей заболело. На пике болезни у них были взяты кровь и мозг. При титровании сгустка крови и мозговой суспензии методом бляшек была выявлена гетерогенность вирусной популяции. Соотношение крупных и мелких бляшек было примерно 1:1. Их этих популяций были изолированы крупнобляшечные клоны 51, 53 и 56. Вирионы всех клонов вели себя в РИЭФ как вирионы штамма ЭК-328. Секвенирование гена Е показало, что все эти клоны являются истинными ревертантами. Аминокислотные остатки в позициях 122 и 426, были как у штамма ЭК-328, но они сохранили н.т. замены, по которым вариант М отличается от штамма ЭК-328. Это свидетельствует о том, что при репродукции адаптированного к клещам варианта М in vivo изменение структуры популяции может идти за счет появления ревертантов.

Таблица 10. Характеристика ревертантов, появляющихся в популяции варианта М при пассажах in vivo.

*- + - наличие катодного преципитата вирионов с АТ, - отсутствие катодного преципитата вирионов

Далее мы попытались оценить влияние данных вирусов друг на друга при одновременной репродукции. Для этого клетки СПЭВ были инфицированы раздельно и смесью вирусов, взятых в разных соотношениях. Полученное потомство оценивали по соотношению крупных и мелких бляшек при титровании в культуре клеток СПЭВ, а также по его поведению в РИЭФ. Очевидно, что такой эксперимент может дать только приблизительные данные о соотношении вирусов с разными фенотипами в популяции. Тем не менее, было поставлено 3 подобных эксперимента, и во всех были получены сходные результаты. Данные одного из этих экспериментах приведены в табл. 11. При равном количестве штамма Эк-328 и варианта М в инокуляте при средней множественности заражения вирусы с разным фенотипом не мешают репродукции друг друга, а при низкой множественности титры варианта М даже увеличиваются. При этом при определенных соотношениях вирусов в инокуляте вариант М может снижать титры штамма Эк-328 и наоборот.

Необходимы тщательные исследования по изучению взаимодействия описанных вирусов при смешанной инфекции на генетическом уровне, а также изучение механизмов описанной интерференции и комплементации. Тем не менее, этот эксперимент и результаты обратных пассажей адаптированного к клещам варианта М показывают, что в клетках млекопитающих ВКЭ может длительно существовать в виде стабильной гетерогенной популяции, в которой присутствует как варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции в клетках млекопитающих, так и варианты, имеющие преимущества при репродукции в членистоногих.

При выделении мелкобляшечных клонов из популяции варианта М, т.е. при создании эффекта «бутылочного горлышка», в результате 1 пассажа в культуре клеток мы получили целый набор ревертантов с обратными и различными компенсирующими мутациями. Это свидетельствует о том, что образование мутантов является при определенных условиях частым событием при репродукции ВКЭ. Нельзя исключить, что подобные мутанты в следовых количествах могут возникать и длительно существовать в любой популяции, тем не менее, за счет интерференции основной популяции они так и остаются в следовых количествах. При клонировании селективное давление основной популяции снижается, и это приводит к резкому изменению структуры популяции с преобладанием более приспособленного к данным условиям варианта вируса.

Очевидным является вопрос. Если адаптация ВКЭ к клещам приводит к появлению таких мутантов с ГАГ-связывающим фенотипом, то подобные вирусы должны постоянно выявляться в клещах. Естественно нельзя ожидать, что все изоляты ВКЭ, выделенные из клещей, должны обладать таким фенотипом, поскольку неизвестно, на какой стадии адаптации в клещам находится этот вирус и как быстро такой вариант может отбираться в клещах в природных условиях, поскольку ВКЭ может длительное время циркулировать в популяции клещей без попадания в млекопитающих на счет трансфазовой или трансовариальной передачи.

Таблица 11. Характеристика вирусного потомства при смешанной инфекции клеток СПЭВ вариантом М и штаммом Эк-328 , взятых в разных соотношениях

* - оценивали по количеству крупных бляшек; ** - оценивали по количеству точечных бляшек; *** - + - наличие катодного преципитата вирионов, - отсутствие катодного преципитата вирионов. В предварительных экспериментах было показано, что вирионы штамма ЭК-328, полученные при концентрировании КЖ, содержащей 6lgPFU, образуют катодный преципитат с АТ в РИЭФ. **** - как отмечалось ранее, так и данном эксперименте, при титровании варианта М иногда на фоне большого количества точечных бляшек можно было выявить 1-2 крупные бляшки.

Из клещей, собранных в разных регионах России, часто выделяют вирусы с мелкобляшечным фенотипом. Нами были просмотрено более 100 вируссодержащих клещевых суспензий, выделенных в разных регионах РФ. Более половины имели мелкобляшечный фенотип или представляли собой смешанную популяцию, которая в процессе лабораторных пассажей через мозг белых мышей или в культуре клеток СПЭВ превращались в вирусы с крупными бляшками (Карганова, 1991; Погодина и др., 1991; Карганова и др., 1992, 1994; неопубликованные данные). Часть из них были изучены подробнее, и было показано, что их свойства близки свойствам варианта М, в том числе у этих вирусов отсутствует ГА, вирионы не образуют преципитаты с АТ в РИЭФ. Естественно, нужны специальные исследования, чтобы установить, что представляют собой изоляты ВКЭ из клещей с мелкобляшечным фенотипом, связана ли мелкая бляшка с особенностями связывания вирионов в ГАГ клетками, и какую роль в их возникновении играет длительность пребывания в клещах. Тем не менее, очевидно, что в природной популяции в клещах циркулируют вирусы, обладающие фенотипом, близким адаптированному в лабораторных условиях к клещам варианту М, который представлен в данной работе.

Полученные данные относятся к лабораторной модели, которая не может быть просто экстраполирована на природную популяцию вируса КЭ. Тем не менее, описанный нами полиморфизм популяции вируса КЭ позволяет объяснить его способность к быстрой адаптации к новому хозяину. Схематично это можно объяснить следующим образом. Быстрое размножение вируса в новом хозяине осуществляется за счет активной репродукции либо уже присутствующих в популяции, либо вновь возникших мутантов, приспособленных к репродукции именно в этом виде хозяина. При этом основная популяция не может подавлять репродукцию этих мутантов, т.к. новый хозяин является для нее непермиссивной системой. При этом, по-видимому, наиболее неожиданные мутанты могут быть получены при репродукции вируса в совершенно новом хозяине, с которым этот вирус еще не встречался. Представленные нами данные показывают, что важную роль в этом играют мутации, определяющие начальные этапы взаимодействия вируса КЭ с клетками. Вероятно, определенное значение могут иметь и мутации, определяющие наиболее эффективное взаимодействие вирусной РНК и белков и клеточных факторов, формирующих репликативный комплекс, или участвующих в подавлении защитных средств клетки, в первую очередь, индукцию ИФН или ИФН сигнальные пути.