Автореферат: Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита

a Аминокислотная позиция в соответствующем белке, нумерация с начала соответствующего белка

В отдельных пробирках готовили контрольные вирусы, которые выдерживали в тех же условиях. После адсорбции сефарозу осаждали, супернатант собирали. Полученные пробы несорбированного на сефарозе и контрольного вируса титровали методом бляшек в культуре клеток СПЭВ (Romanova et al., 2007). Сорбция вирионов адаптированного к клещам варианта М на ГС оказалась выше, чем у вирионов штамма Эк-328 (рис.3), т.е. М вариант обладает ГАГ-связывающим фенотипом.

Варианты с подобным ГАГ-связывающим фенотипом описаны для многих вирусов (Byrnes and Griffin, 2000; Hulst et al., 2000; Lin et al., 2000), в том числе и флавивирусов японского энцефалита (ЯЭ), лихорадки Западного Нила (ЛЗН) и энцефалита Долины Муррей (ЭДМ) (Lee and Lobigs, 2002; Lee et al., 2004), в частности ВКЭ (Mandl et al., 2001; Goto et al., 2003). Для всех подобных вариантов характерна низкая виремия и низкая НИ для лабораторных мышей.

Рисунок 3. Процент вируса, сорбированного на ГС, для штамма ЭК-328, варианта М и клонов 160/57, 116/59 и 103/84.

В наших экспериментах появление вируса с ГАГ-связывающим фенотипом наблюдали при адаптации штамма ВКЭ сибирского генотипа к клещам H. m. marginatum. Доктор Чунихин с соавт. (1986) адаптировали к клещам H. anatolicum 4 штамма ВКЭ, выделенных в Сибири и на дальнем Востоке. Во всех случаях в результате пассажей на клещах были получены мелкобляшечные варианты с низкой НИ для мышей. Вирионы всех полученных вариантов, подобно нашему варианту М, не образовывали преципитата с АТ в РИЭФ. Таким образом, разные штаммы ВКЭ имели сходную изменчивость при адаптации к клещам, относящимся к роду Hyalomma, которые не являются переносчиками этого вируса в природных очагах. Доктор Labuda с соавт. (1994) получили сходное изменение свойств ВКЭ при пассировании штамма европейского генотипа к клещам I.ricinus, которые являются основным переносчикам этого вируса. При этом авторы наблюдали снижение НИ вируса и выявили а.к. замену в позиции 84 белка Е, которая приводит к повышению положительного заряда вирионов и может обеспечивать ГАГ-связывающий фенотип полученного мутанта. Все перечисленные факты позволяют предположить, что появление вариантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом является закономерностью при адаптации ВКЭ к клещам.

Для оценки влияния выявленных в белке Е замен на антигенные свойства вирусов были изучены вирионы штамма ЭК-328 и варианта М с помощью моноклональных АТ (моноклонАТ) в иммуноферментном анализе (ИФА) и с использованием преципитации меченых вирусных белков (РИП) из лизатов инфицированных клеток СПЭВ. Для сравнения брали штамм Софьин (дальневосточный генотип) и штамм Рс (европейский генотип) так, чтобы в реакции были представлены все 3 генотипа ВКЭ. ИФА проводили по непрямому методу (Романова и др., 2006). С помощью ИФА определили, что моноклонАТ E6B значительно слабее взаимодействуют с вариантом М, по сравнению со штаммами ЭК-328, Рс и Софьин (табл. 3). E6B является нейтрализующим и обладающим антиГА активностью моноклоном к эпитопу, принадлежащему к антигенному домену е2 белка Е, согласно эпитопной карте Цехановской с соавт. (1993). МоноклонАТ Е4А, не обладающие нейтрализующими и антиГА свойствами, также различили штамм ЭК-328 и вариант М.

Таблица 3. Сравнение антигенной структуры вирионов штамма Эк-328 и варианта М с помощью набора моноклональных АТ к белку Е.

* по опубликованным данным (Гайдамович и др., 1990; Протопопова и др., 1996, 1997)

В РИП оценивали количество белка, которое преципитируют моноклонАТ из лизатов клеток СПЭВ, инфицированных вышеперечисленными штаммами, по отношению к количеству белка, преципитированного из этого лизата -глобулином против ВКЭ (Романова и др., 2006). МоноклонАТ 7F10 к эпитопу в домене е1 статистически достоверно более активно преципитировали белок Е штамма ЭК-328, по сравнению с вариантом М.

МоноклонАТ, различившие в данной работе белок Е варианта М и исходного штамма ЭК-328, связываются с эпитопами в разных антигенных доменах белка Е. Следовательно, изменение антигенной структуры у варианта М затрагивает удаленные эпитопы этого белка.

Взаимодействие вирионов ВКЭ с рецепторами на поверхности клеток.

Представленные выше данные показывают, что адаптация к клещам приводит к селекции вариантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. В связи с этим мы попытались более подробно изучить адсорбцию вирионов ВКЭ на клетках с целью лучше понять, какую роль в процессе проникновения вирионов в клетку могут играть ГАГ. К началу данного исследования сведения о природе рецепторов на поверхности клеток для флавивирусов и, в частности, для ВКЭ отсутствовали.

Для анализа связывания вирионов ВКЭ использовали штамм Софьин. Вирионы метили по РНК при выращивании в клетках почек зеленых мартышек 46-47 в присутствии [Н3]-уридина (Timofeev et al., 1991). Меченые вирионы концентрировали с помощью ультрацентрифугирования и использовали для экспериментов по адсорбции на клетках СПЭВ. Клетки выращивали в 96-лучночных пластинах. К монослоям добавляли возрастающие концентрации меченого вируса. Проводили адсорбцию в течение 2 часов при +40С. После адсорбции собирали не связавшийся с клетками вирус, промывали клеточный монослой средой и собирали клетки. Определяли количество связавшегося и свободного вируса. Полученные результаты представляли в координатах Скэтчарда (Scatchard, 1949). Взаимодействие лиганда с одним рецептором в этих координатах описывается прямой линией, которая отсекает на оси ординат константу связывания, а на оси абсцисс - количество рецепторов данного типа. Если лиганд связывается с двумя или большим количеством типов рецепторов, то в данной системе процесс описывается гиперболой или линией более высокого порядка. Асимптоты к плечам гиперболы характеризуют соответствующие типы рецепторов, которые различаются аффинностью связывания с лигандом. Под одним типом рецепторов могут выступать химически разные молекулы.

Как видно на рис. 4, в координатах Скэтчарда взаимодействие вирионов ВКЭ с клетками описывается гиперболой. Один из рецепторов характеризуется высокой константой связывания и представлен небольшим количеством на поверхности клеток. Второй, низкоаффинный рецептор, связывает практически все вирионы ВКЭ. Таким образом, адсорбция вирионов ВКЭ на клетках обусловлено взаимодействием с двумя типами рецептором: высокоаффинными и низкоаффинными.

Рис.4. Результаты связывания меченных [3H]-уридином вирионов ВКЭ на монослое клеток СПЭВ, выраженные в координатах Скэтчарда

+ - экспериментальные данные;

-- -аппроксимированная кривая;

-- асимптоты к аппроксимированной кривой. Аппроксимированная кривая рассчитана методом наименьших квадратов. Асимптоты рассчитаны, согласно работе Варфаламеева и др. (1980)

Для выяснения природы клеточных рецепторов, обуславливающих вышеописанные взаимодействия вирионов ВКЭ с клетками, клетки СПЭВ обрабатывали раствором ТРСК-трипсина в течение 15 минут при комнатной температуре и проводили адсорбцию меченого вируса. Обработка клеток трипсином полностью блокировала высокоаффинное связывание вирионов с клетками. Эти данные позволили сделать предположение о белковой природе высокоаффинного рецептора.

Для более детального изучения предполагаемого клеточного белкового рецептора была получена антиидиотипическая сыворотка к поверхностному гликопротеину Е ВКЭ. Для этого мыши были однократно иммунизированы 50мкг очищенного белка Е (Timofeev et al., 1991). Для получения сыворотки у мышей была взята кровь из супраорбитальной вены на 9 (нормальный иммунный ответ на введение антигена) и 35 сутки после иммунизации (время максимального накопления антиидиотипических антител). Сыворотка мышей, взятая на 9 сутки после иммунизации, преципитировала из лизата клеток СПЭВ, инфицированных ВКЭ, белок Е. Сыворотка, взятая у тех же мышей на 35 сутки после иммунизации белком Е, содержала антиидиотипические антитела к этому белку, поскольку в ИФА при взаимодействии с иммуноглобулином против ВКЭ вела себя, как антиген.

Обработка клеток сывороткой с антиидиотипическими антителами перед адсорбцией вируса практически полностью блокировала связывание вирионов ВКЭ на высокоаффинном рецепторе. Данная сыворотка в РИП белков, меченных смесью [C14]-аминокислот или [C14]-глюкозамином, из лизатов незараженных клеток СПЭВ преципитировала только гликопротеин с мол. массой около 110 кДа.

В последствие появился ряд работ, в которых с помощью антиидиотипических поликлональных и моноклонАТ был выявлен целый набор претендентов в рецепторы для вирионов ВКЭ (Протопопова и др, 1996, 1997; Kopecky et al., 2005). С помощью моноклонАТ к нейтрализующим моноклонАТ к белку Е (в том числе к использованным в данной работе Е6В) из нескольких культур клеток были выделены белки с мол. массами 43, 67, 110, 210 кДа (Протопопова и др., 1996, 1997). Было показано, что белок 110 кДа является ?1-цепью, а белок 210 кДа -?3-цепью интегрина. Для вирусов ЛЗН и ЯЭ так же показано, что ?v?3-интегрин является общим для этих вирусов рецептором на поверхности клеток Vero, HeLa, N2A (клетки мышиной нейробластомы) (Chu and Ng, 2004), и этот рецептор опосредует проникновение вирионов в клетку.

Выявленный белок с мол. массой 67 кДа оказался - ламининсвязывающим белком (ЛСБ) и был предложен авторами в качестве рецептора для ВКЭ с константой связывания 2,5х107 М-1, т.е. низкоаффинного рецептора (Protopopova et al., 1997; Локтев и др., 2002).

Представленные данные позволяют высказать предположение, что на поверхности белка Е ВКЭ есть участок, структурно близкий рецепторной области ламинина, который может взаимодействовать с разными типами рецепторов для ламинина. Таким образом, взаимодействие ЛСБ и ГАГ с белком Е ВКЭ может иметь сходный механизм, поскольку ГАГ могут выполнять функции ко-рецепторов для ламинина.. Выявленная нами замена в 122 позиции белка Е глутаминовой кислоты на глицин, повышает положительный заряд белка Е и приводит к повышению связывания с ГАГ клетки. В наших экспериментах, в отличие от родительского штамма ЭК-328 вариант М, имеющий такую замену, слабо взаимодействует с моноклонАТ Е6В к эпитопу белка Е ВКЭ, отвечающему за связывание с ЛСБ на поверхности клетки. Это позволяет предположить, что ГАГ и ЛСБ могут служить в качестве одного из ко-рецепторов для разных вариантов ВКЭ, при этом адаптация к новому хозяину может сопровождаться изменением связывания с этими рецепторами.

Таким образом, нами впервые было показано, что ВКЭ имеет два типа рецепторов на поверхности клетки: высокоаффинный, по-видимому, белковой природы, с которым связывается менее 1% сорбированных вирионов, и низкоаффинный, с которым связывается основная масса вирионов ВКЭ.

Изменение патогенетических характеристик ВКЭ при адаптации к клещам и переадаптации к млекопитающим.

Сравнение вирулентности штамма Эк-328 и варианта М проводили на мышах линии Balb/c разного возраста, которые были инокулированы и/ц и интраперитонеально (и/п). Для сравнения использовали штамм Абсеттаров ВКЭ, обладающий высокой нейроинвазивностью для мышей этой линии.

Как видно из табл. 4, все изученные вирусы обладали близкой нейровирулентностью для мышей 6 и 12 г. В экспериментах на взрослых мышах штамм Эк-328 продемонстрировал несколько меньшую НИ, чем штамм Абсеттаров, исходя из данных о количестве БОЕ, необходимых для того, чтобы вызвать 50% гибель животных. НИ варианта М была в 10000 раз ниже, чем у штамма ЭК-328.

Таблица 4. Вирулентность штамма Эк-328, варианта М и штамма Абсеттаров ВКЭ для мышей BALB/c разного возраста