II. По способу усвоения азотистых веществ микроорганизмы подразделяют на четыре группы:
·Протеолитические, способные расщеплять нативные белки, пептиды, аминокислоты.
·Дезаминирующие, способные отщеплять аминогруппы только у свободных аминокислот.
·Нитритно-нитратные, усваивающие окисленные формы азота.
·Азотфиксирующие, обладающие свойством усваивать атмосферный азот.
21. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам. Рост и размножение бактерий. Фазы роста на жидких питательных средах
классификации питательных сред по консистенции питательные среды разделяют на плотные (твёрдые), полужидкие и жидкие. При классификации питательных сред по составу выделяют белковые, безбелковые и минеральные среды. При классификации питательных сред по происхождению среды разделяют на искусственные и естественные (природные).
Искусственные среды разделяют на животные [например, мясопептонный агар (МПА) или мясопептонный бульон (МПБ)] и растительные (например, настои сена и соломы, отвары злаков, дрожжей или фруктов, пивное сусло и др.).
Естественные питательные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортировки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культивирования {универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды для выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентификации (дифференциальные и элективно-дифференциальные).
Требования к питательным средам:
Среды должны быть питательными, т.е. содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества: Среды должны быть изотоничными, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же как и внутри клетки, для чего в среду добавляют 0,5 %
Среды должны быть стерильными для обеспечения возможности выделения чистой культуры
Среды должны содержать достаточное количество доступной воды т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии.
Среды должны обладать определенным ОВП, т.е. соотношением вещевст, отдающих и принимающих е
Среды должны быть прозрачными - удобнее следить за ростом культур
Среды должны быть по возможности унифицированными по содержанию основных компонентов: содержание аминного азота, общего азота, содержание хлоридов, пептона.
Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные -- путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.
Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий.
При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов:1. лаг-фаза;2. фаза логарифмического роста; 3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрациибактерий; 4. фаза гибели бактерий.
Лаг-фаза -- период между посевом бактерий и началом размножения. Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом интенсивного деления бактерий. Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями (S- и R-формы), различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий.
22. Принципы и методы выделения чистых культур микроорганизмов. Культивирование бактерий
Принципы и методы выделения чистых культур бактерий.
Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты -- биовары. Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам -- сероварами, по чувствительности к фагу -- фаговарами. Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо символами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами.
Колония представляет собой видимое изолированное скопление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее).
Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований -- идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизма.
форму колоний - округлая, амёбовидная, неправильная, ризоидная и т.д.;
поверхность колонии - гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, радиально исчерченная, с концентрическими кругами;
профиль колонии - плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный, выпуклый в центре с валиком по краю, вдавленный в центре, с валиком по краю и др.;
блеск и прозрачность - блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная;
цвет колонии - бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная - белая, жёлтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, чёрная. Особо отмечают выделение пигмента в субстрат;
край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый, корневидный и др.;
структуру колонии - однородная, мелко- и крупнозернистая, струйчатая (край и структуру колонии определяют с помощью лупы или при малом увеличении микроскопа);
консистенцию колонии - её определяют, прикасаясь к колонии петлей.
Методы выделения чистых культур бактерий.
Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри -- металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надписывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры).
Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.
Способы культивирования микроорганизмов
Стационарный способ. При культивировании этим способом питательные среды сохраняются постоянными, никаких манипуляций с ними не производят. Преобладают анаэробные энергетические процессы. Выход биомассы незначителен.
Глубинный способ с аэрацией. Глубинное культивирование проводят в реакторах в герметичных котлах с жидкой питательной средой, оборудованных автоматическими приспособлениями для контроля рН, О2, температуры, поступления стерильного воздуха и т.д. (цв. вклейка, рис. VII).
Проточный способ культивирования позволяет клеткам длительное время находиться в определенной фазе роста (экспоненциальной) при постоянной концентрации питательных веществ и в одних и тех же условиях, обеспечивающих непрерывный рост культуры. Метод основан на том, что в культивируемую суспензию непрерывно добавляют свежую питательную среду и одновременно удаляют соответствующее количество бактерий.
23.Действие физических и химических факторов на микроорганизмы, Использование в практике. Стерилизация, способы, аппаратура. Дезинфекция. Дезинфектанты
Влияние физических факторов.
Влияние температуры. Различные группы микроорганизмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) -- мезофилами, при высокой -- термофилами.
К психрофильным микроорганизмам относится большая группа сапрофитов -- обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся бактерии, бациллы). Мезофилы включают основную группу патогенных и условно-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10-- 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.
При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развиваются термофильные бактерии. Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена.
Высушивание. Обезвоживание вызывает нарушение функций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гонореи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты.
Высушивание под вакуумом из замороженного состояния -- лиофилизацию -- используют для продления жизнеспособности, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные культуры микроорганизмов и иммунобиологические препараты длительно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств.
Действие излучения. Неионизирующее излучение -- ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение -- гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени.
Действие химических веществ. Химические вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост.
Стерилизация (обеспложивания, «sterilis»--бесплодный)- полное уничтожение объекта от всех микроорганизмов, находящихся как в вегетативных, так и споровых формах. Для стерилизации применяют в основном физические методы: стерилизация в сушильно-стерилизационном шкафу, стерилизация текучим паром, тиндализация, автоклавирование, прокаливание, воздействие ионизирующих излучений, кипячение. Методы стерилизации
Физические методы стерилизации.
1. Прокаливание на огне - фламбирование ( спиртовка) -- применяется для стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл , предметных стекол, пинцетов.
2. Кипячение--применяется редко. Кипячением в воде в течение 10-40 минут можно стерилизовать многоразовые шприцы, иглы.
3. Стерилизация сухим жаром производится в печах Пастера.
4. Стерилизация паром проводится при более низкой температуре чем стерилизация сухим жаром, и производится при температуре в 100--120°. Различают: 1)Стерилизация паром под давлением -- основан на том, что образующийся пар не выходит наружу, а скопливается в замкнутом пространстве и повышает давление. 2)Стерилизация паром под давлением производится в автоклавах. На сегодняшний день это самый распостраненный способ стерилизации в бактериологической практике
Автоклав представляет, собой металлическую цилиндрическую емкость с толстыми двойными стенками и с герметически закрывающейся массивной крышкой. Автоклав оборудован манометром и термометром для контроля давления и температуры . Под дном автоклава находятся нагревательные элементы . стерилизуемые предметы помещают внутрь емкости и герметично закрывают крышку, начинается повышение давления и температуры.