Споры - своеобразная форма покоящихся бактерий с грамположительным типом строения клеточной стенки. Спорообразующие бактерии рода Bacillus, у которых размер споры непревышает диаметр клетки, называются бациллами. Спорообразующие бактерии, у которых размер споры превышает диаметр клетки, отчего они принимают форму веретена, называются клостридиями, например бактерии рода Clostridium (от лат.Clostridium - веретено). Споры кислотоустойчивы, поэтому окрашиваются по методу Ауески или по методу Циля-Нельсена в красный, а вегетативная клетка - в синий цвет.Спорообразование, форма и расположение спор в клетке (вегетативной) являются видовым свойством бактерий, что позволяет отличать их друг от друга. Форма спор бывает овальной и шаровидной, расположение в клетке - терминальное, т.е. на конце палочки (у возбудителя столбняка), субтерминальное - ближе к концу палочки (у возбудителей ботулизма, газовой гангрены) и центральное (у сибиреязвенной бациллы). Спора долго может сохраняться из-за наличия многослойной оболочки, дипиколината кальция, низкого содержания воды и вялых процессов метаболизма.
Капсула бактерий - это утолщенный наружный слой клеточной стенки. Капсулы могут быть построены из полисахаридов (пневмококк) или белков (возбудитель сибирской язвы). Большинство бактерий, особенно патогенных, образует капсулу только в организме человека или животных. Однако существует род истинно капсульных бактерий (Klebsiella), представители которого образуют капсулу и при культивировании на искусственных питательных средах. Некоторые бактерии могут иметь микрокапсулу (выявляется только при электронной микроскопии), например, эшерихии, или неявно выраженную способность к капсулообразованию - так называемую "нежную" капсулу, например, золотистые стафилококки, менингококки.Основное предназначение капсул - защита бактерий от фагоцитоза. При окраске мазков по Граму истинно капсульные бактерии имеют характерное взаиморасположение (на расстоянии друг от друга). При световой микроскопии капсулы четко не видны, в связи с чем наличие капсул у бактерий выявляется с помощью специальных методов окраски, например, по методу Гимзе. Для выявления капсул и бактерий, образующих их в организме, используют либо микроскопию мазков, приготовленных из патологического материала или мазков - отпечатков из органов погибших животных.
Подвижность
Метод «раздавленной капли»
Культуру в изотоническом растворе хлорида натрия наносят на предметное стекло и сверху накладывают покровное. Капля материала должна быть такой величины, чтобы она заполняла все пространство между покровным и предметным стеклом и не выступала за пределы покровного. Препарат рассматривают с иммерсионной системой и слегка опущенным конденсором.
Метод «висячей капли»
Необходимо иметь предметное стекло с лупочкой. Каплю культуры наносят на покровное стекло, сверху накладывают предметное стекло с лупочкой посредине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предметное стекло слегка прижимают к покровному, и препарат переворачивают покровным стеклом кверху. Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.
9.Тинкториальные свойства бактерий. Цели и методы окраски
Тинкториальные свойства бактерий, характеризующие их способность вступать в реакцию с красителями и окрашиваться определенным образом.
Существуют простые, сложные и дифференциальные способы окрашивания микробов. При простой окраске обычно употребляют одну краску, чаще всего красную -- фуксин, или синюю -- метиленовый синий. Фуксин красит быстрее (1--2 мин.), метиленовый синий -- медленнее (3--5 мин.). Сложные способы окраски, при которых применяются два или более красителя, являются ценными методами, используемыми в микробиологической диагностике инфекционных болезней.
Окраска по методу Грама:
На фиксированный мазок нанести основной краситель - генциановый фиолетовый через полоску фильтровальной бумаги. Выдержать 2 мин. Не промывая мазок, нанести раствор Люголя на 1 мин. Обесцветить этиловым спиртом 5-10 сек. Промыть водой. Нанести раствор водного фуксина на 1-2 мин. Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные в красный. Принцип метода заключается в том что генциановый фиолетовый связывается с пептидогликаном клеточной стенки. Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя. Тонкий слой - грамортицательных - мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются. А грамположительные микрооганизмы остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет.Окраска по Граму имеет дифференциально-диагностическое значение. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки и др., к грамотрицательным - гонококки, кишечная палочка, менингококки и др. Некоторые виды окрашиваются по Граму вариабельно в зависимости от различных внешних и внутренних факторов.
Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:
На фиксированный мазок нанести нанести фильтровальную бумагу, пропитанную карболовым фуксином Циля и прогреть в течение 3-5 мин.
Промыть водой.
Нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 мин для обесцвечивания.
Промыть водой.
Докрасить мазок раствором метиленового синего 3-5 мин.
Промыть водой, высушить.
В основе метода лежат разрыхление клеточной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кислотоустойчивые бактерии отличаются высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии окрашиваются дополнительным красителем.
10.Иммерсионный микроскоп. Особенности устройства. Принцип действия. Использование в практике
Иммерсия (иммерсионный метод микроскопического наблюдения) в оптической микроскопии -- это введение между объективом микроскопа и рассматриваемым предметом жидкости для усиления яркости и расширения пределов увеличения изображения.
Иммерсионная система -- оптическая система, в которой пространство между первой линзой и предметом заполнено жидкостью. Применяемая таким образом жидкость называется иммерсионной.
Иммерсионные объективы. Качество изображения, параметры и оптическая конструкция иммерсионных объективов рассчитываются и выбираются с учетом толщины слоя иммерсии, которая рассматривается как дополнительная линза с соответствующим показателем преломления. Иммерсионная жидкость, расположенная между объектом и фронтальным компонентом объектива, увеличивает угол, под которым рассматривается объект (апертурный угол). Числовая апертура безыммерсионного (сухого) объектива не превышает 1,0 (разрешающая способность порядка 0,3 мкм для основной длины волны); иммерсионного -- доходит до 1,40 в зависимости от показателя преломления иммерсии и технологических возможностей изготовления фронтальной линзы .
Иммерсионные объективы больших увеличений имеют короткое фокусное расстояние -- 1,5-2,5 мм при свободном рабочем расстоянии 0,1-0,3 мм (расстояние от плоскости препарата до оправы фронтальной линзы объектива).
Применяются:Кедровое или минеральное масло ,Водный раствор глицерина ,Физиологический раствор ,Вода , Вазелиновое масло ,Йодистый метилен
11.Методы микроскопического исследования (люминесцентная, темнопольная, фазово-контрастная, электронная микроскопия). Бактериоскопический метод диагностики, ею задачи и возможности
Темнопольная микроскопия
Применяется для прижизненного изучения микроорганизмов в нативных неокрашенных препаратах.Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при боковом освещении частиц, взвешенных в жидкости эффект Тиндаля) Эффект достигается с помощью специального конденсора ( парабалоид или кардиоид), которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе. При этом способе освещения в объектив попадают только лучи, отраженные от поверхности объекта. В результате на темном фоне (неосвещенное поле зрения) видны ярко освященные частицы. Для наблюдения в темном поле свет устанавливают и центрируют, как и для светлого поля,заменяют конденсор на специальный, прибавляют свет до максимума, открывают конденсор до максимума. Для темнопольной микроскопии готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля»
3.Люминисцентная микроскопия.
Люминисценция - способность некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи сдругой длиной волны.( например, таким свойством обладают ультрафиолетовые лучи). Объект, не видимый в ультрафиолетовом излучении, приобретает яркий блеск после обработки специальными веществами-флюорохромами. Установка для люминисцентной микроскопии состоит из источника света с сине-фиолетовым фильтром и микроскопа. На окуляр микроскопа надевают желтый светофильтр.Преимущества люминисцентной микроскопии:1.цветное изображение2.высокая степень контрастности объектов3.возможность исследования непрозрачных объектов4.возможность исследования динамики жизненных процессов5.обнаружение локализации отдельных микроорганизмов, вирусов6.развитие методов цитогистохимии, экспрессная цитодинамика.
4.Фазово-конртастная микроскопия
Предназначена для нативных препаратов. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть прозрачные объекты. Свет проходит через различные биологические структуры с разной скоростью, которая зависит от оптической плотности объекта. В результате возникает изменение фазы световой волны, не воспринимаемое простым глазом. Фазовое устройство состоит из особого конденсора и объектива и обеспечивает преобразование изменение фазы световой волны в видимые изменения амплитуды. Таким образом достигается усиление различий в оптической плотности объектов.
5.Электронная микроскопия.
Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа.(0,2 мкм). Применяются для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов.
Световые лучи в этом микроскопе заменяют поток е, имеющий 0,005 нм. Высокая разрещающая способность электронного микроскопа (0,1-0,2 нм) позволяет получить общее полезное увеличение до 1000000.
Микроскопический (бактериоскопический) метод.Суть метода: из исследуемого материала по общепринятой методике готовят мазок, окрашивают его и путем микроскопического изучения обнаруживают микробы, исследуют их морфологические, тинкториальные свойства, расположение микробов в мазке относительно друг друга. Достоинства метода:быстрое получение результатов, техническая и экономическая доступность, простота.
Недостатки метода. Морфология, особенно родственных микроорганизмов, нередко идентична, и они не идентифицируются в световом микроскопе. Под действием ряда факторов внешней среды, в первую очередь, антибиотиков микроорганизмы могут изменять свою характерную морфологию. Концентрация возбудителей может быть чрезвычайно низкой, поэтому они не обнаруживаются, или форменные элементы их маскируют. Эти обстоятельства приводят к тому, что этот метод редко используется как окончательный способ установления этиологии заболевания. Чаще он используется как ориентировочный, предварительный метод исследований, а при некоторых видах инфекции он вообще опускается. Бактериолог, получив ориентировочные сведения о предполагаемом возбудителе, его концентрации, сочетании с сопутствующей микрофлорой, определяет тактику дальнейшего выделения чистой культуры возбудителя.
12.Ферменты бактерий. Понятие о биохимических свойствах микроорганизмов. Автоматическая регуляция синтеза ферментов. Идентификация бактерий по ферментативной активности
Ферменты участвуют во всех обменных процессах. Ферменты делятся на экзоферменты, которые выделяются в окружающую среду, где они расщепляют питательные вещества. Эти вещества поступают внутрь клетки, где расщепляются эндоферментами.
По постоянству действия:
- Ферменты, постоянно участвующие в обменных процессах - конституитивные. Они принимают активное участие в синтезе структурных компонентов.
- Ферменты, действующие только при наличии субстрата - адаптационные: ферменты транспорта и катаболизма лактозы - галактоздпермиаза, -галактозидаза, галактозидацетилтрансфераза.
В целях диагностики определяют такие ферменты: лецитиназа, уреаза, сахараза, мальтаза, гиалуронидаза,
Ферменты патогенности:1) гиалуронидаза - расщепляет ГАГ (матрикс соедин. ткани), что облегчает механическое продвижение по ткани2) уреаза - расщепляет мочевину с образованием аммиака, что помогает выжить в очень кислой среде3) гемагглютинины - запускают агглютинацию крови, что создает благоприятные условия для роста и размножения моргов.4) лецитиназа - расщепляет желток куриного яйца5) пенициллаза - расщепляет пенициллин (первый антибиотик)
Микроорганизмы синтезируют различные ферменты - специфические белковые катализаторы. 1. Оксидоредуктазы - катализируют окислительно- восстановительные реакции.2. Трансферазы - осуществляют реакции переноса групп атомов.3. Гидролазы - осущесвляют гидролитическое расщепление различных соединений.4. Лиазы - катализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям.5. Лигазы или синтетазы - обеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.6. Изомеразы - определяют пространственное расположение групп элементов.
В бактериологии для дифференциации микроорганизмов по биохимическим свойствам основное значение часто имеют конечные продукты и результаты действия ферментов. В соответствии с этим существует микробиологическая (рабочая) классификация ферментов.
1.Сахаролитические.2.Протеолитические.3.Аутолитические.4.Окислительно - восстановительные. 5.Ферменты патогенности (вирулентности).
Идентификация бактерий по ферментативной активности.