отличалась от обычной аминокислоты заменой изотопа 14N на 15N. Через некоторое время он выделил из крови гемоглобин затем гемин, содержащий повышенное количество изотопа 15N. Позднее было показано, что глицин конденсируется с сукцинил-коэнзимом А, давая δ-аминолевулиновую кислоту (δ-АЛК). Этот процесс катализируется ферментом АЛК-синтетазой, его обязательным участником является фосфорилированная форма витамина В6 – пиридоксальфосфат. Последующими исследованиями было доказано, что δ- АЛК выступает в качестве общего предшественника в биосинтезе всех природных тетрапиррольных пигментов. Описанное образование δ-АЛК характерно для животных и ферросинтетических бактерий. В растениях и у некоторых прокариотов δ-АЛК синтезируется из глютаминовой кислоты.
Две молекулы δ-АЛК под действием фермента порфобилиноген-синтетазы конденсируются в молекулу пиррола, получившего название «порфобилиноген» (ПБГ). Следующая стадия биосинтеза – превращение четырех молекул ПБГ в макроцикл уропорфириноген III (Уро’ген III). Конденсация ПБГ в Уро’ген III состоит из двух этапов. На первом происходит полимеризация ПБГ под действием фермента ПБГ-деаминазы в линейный тетрапиррол. На втором в присутствии фермента косинтетазы происходит не только замыкание билана в макроцикл, но и поворот одного из пиррольных колец с образованием природного изомера III типа – Уро’гена III. При отсутствии косинтетазы билан замыкается в другой изомер – Уро’ген I, который в последующем биосинтезе не участвует (это очень редкая патология обмена веществ у человека). Только при наличии двух ферментов – дезаминазы и косинтетазы – ПБГ замыкается в изомер III типа. Отдельно взятая косинтетаза не полимеризует ПБГ и не в состоянии изомеризовать Уро’ген I в Уро’ген III. Лишь в начале 90-х годов был окончательно раскрыт механизм образования Уро’гена III.
После получения дезаминазы высокой степени чистоты генноинженерными методами стало возможным показать, что фермент (Е) содержит активный центр – кофактор, состоящий из двух соединенных между собой молекул ПБГ. Этот дипирролилметан ковалентно связан с белком через атом серы остатка цистеина. Молекулы ПБГ последовательно присоединяются к дипирролилметану (с потерей NH3), образуя цепочку из трех (ES1), четырех (ES2), пяти (ES3) и шести (ES4) пирролов, причем все присоединения происходят по типу «голова к хвосту», и, следовательно, полипиррольная цепь имеет регулярно чередующиеся заместители А-Р-А-Р-А-Р- и т.д. После присоединения четвертой молекулы ПБГ тетрапиррольная цепочка отделяется с образованием оксибилана. Дипирролилметан дезаминазы снова готов к наращиванию полипиррольного ансамбля .
Наличие простетической группы в дезаминазе, построенной из молекул, подобных субстрату, – явление необычное для ферментов. Известно только, что, действуя на дезаминазу сильными кислотами, удается отщепить депирролилметан. Полученный апофермент уже не обладает каталитической
11
активностью. Лишь после присоединения двух первых молей ПБГ при определенном pH дезаминаза снова становится способной к обратимому присоединению четырех молекул ПБГ.
Синтезированный оксибилан под действием второго фермента косинтетазы превращается в Уро’ген III. Для этой циклизации, сопровождающейся обращением пиррольного кольца D, за долгие годы изучения этой реакции предложено свыше двух десятков механизмов. В настоящее время наиболее обоснованным представляется поворот кольца D за счет образования спироструктуры (на схеме).
После образования Уро’гена III происходит первое разветвление путей биосинтеза тетрапиррольных пигментов. Декарбоксилирование Уро’гена III ведет к порфиринам и хлорофиллам, а С-метилирование – через прекоррин-1 – к витамину В12 и другим кобаламинам.
3) синтез гемоглобина
Рассмотрим путь, ведущий к главному порфирину в живом организме – протопорфирину IX и его железосодержащему комплексу – протогему. Превращение Уро’гена III под влиянием соответствующего фермента включает последовательное декарбоксилирование остатков уксусной кислоты до метильной группы с образованием копропорфириногена III (Копро’ген III). Декарбоксилирование начинается с кольца D и далее продолжается по часовой стрелке через кольца А,В и С. Имеются также данные, что в определенных условиях возможен и иной порядок декарбоксилирования.
Копроген III под действием копропорфириногеноксидазы подвергается окислительному декарбоксилированию. В результате два остатка пропионовой кислоты превращаются в винильные группы и образуется протопорфирин IX (Прото IX). На этом участке происходит дальнейшее разветвление путей биосинтеза. Введение ионов двухвалентного железа (фермент феррохелатаза) приводит к образованию протогема, который является простетической группой в многочисленных природных белках – гемопротеидах.
4) биосинтез хлорофиллов
Включение в Прото IX магния начинает новую цепь биосинтетических превращений, ведущую к хлорофиллу а, бактериохлорофиллу и другим зеленым пигментам, общее количество которых на сегодня превышает 50 типов.
Существенным отличием этой ветви биосинтеза от ранее рассмотренной является то, что при биосинтезе Прото IX большая часть промежуточных соединений находится в растворах, перемещаясь от одного фермента к другому, причем сами ферменты также по большей части растворены в цитоплазме клетки. Биосинтез хлорофиллов, напротив, протекает только в хлоропластах, все ферменты закреплены в мембранах и часто образуют
12
сложные ассоциаты. Это значительно затрудняет изучение отдельных стадий, механизмов превращений промежуточных соединений, и, в связи с этим, общая картина биосинтеза Хл а остаётся менее ясной.В целом же о биосинтезе известно следующее. После введения иона магния происходит этерификация остатка пропионовой кислоты. Далее этот остаток окисляется через несколько промежуточных стадий, давая после замыкания кольцо. Затем происходит восстановление винильной группы до этильной с образованием 3- винилпротохлорофилла.
Следующая важная стадия включает в себя восстановление двойной связи в кольце . Исключительно важную роль играет при этом освещение растений. Показано, что в отсутствии света у высших растений накапливается протохлорофиллид. Даже короткая световая экспозиция приводит к превращению протохлорофиллида в хлорофиллид. В то же время, низшие растения и водоросли могут синтезировать хлорофиллид и при отсутствии света. На заключительном этапе происходит этерификация хлорофиллида природным спиртом фитолом при участии особого фермента хлорофиллсинтетазы. В результате образуется хлорофилл а .
Пути биосинтеза других хлорофиллов, а также бактериохлорофиллов изучены пока недостаточно. Известно, однако, что все эти пигменты образуются через Хл а. В случае хлорофилла b происходит окисление метильной группы до формильного. Образование самого распространенного
среди бактериохлорофиллов а – изомера |
включает превращение винильной |
|
группы в ацетильную, гидрирование |
второго пиррольного остатка |
и |
этерификацию остатка пропионовой кислоты фитолом. |
|
|
Металлопорфирины являются макроциклическими комплексами, и это накладывает отпечаток на их строение и свойства. Однако, они отличаются от бесчисленного множества других групп макроциклических комплексов тем, что являются ароматическими макроциклами с уникальной сопряженной π- системой. Ароматичность порфиринов определяет их электроннодонорные свойства, то есть способность к снижению локальных положительных и отрицательных зарядов путем их распределения по ароматическим орбиталям. Вследствие этого стабилизируются катион- и анион-радикальные формы, а также различные степени окисления металлов, возникающие в процессе функционирования биологически активных соединений на основе металлопорфиринов.
Изложенные здесь пути биосинтеза протогема и хлорофилла а показывают, насколько близко переплетаются фундаментальные процессы жизнедеятельности в бактериях, высших растениях и животном мире. При значительных различиях объектов исследования в рассмотренных схемах используются близкие или общие методы построения промежуточных соединений.
13
Успешное раскрытие путей биосинтеза «пигментов жизни» можно рассматривать как важный этап в развитии современной молекулярной биологии и биохимии. Полученные знания могут быть использованы и в медицинской практике в борьбе с определенными наследственными заболеваниями, при химических отравлениях и других процессах, связанных с нарушениями биосинтеза гемопротеидов. Примером успешного использования биосинтеза гема явился предложенный недавно модифицированный метод фотодинамической терапии рака, основанный на введении в организм пациента δ-АЛК, которая превращается в Прото IX, а последний накапливается в злокачественных опухолях.
V.Комплексоны и их применение в медицине (хелатотерапия).
Ворганизме непрерывно происходят образование и разрушение биокомплексов из катионов биометаллов (железо, медь, цинк, кобальт) и биолигандов (порфиринов, аминокислот, полипептидов). Обмен веществ с окружающей средой поддерживает концентрации вещества на определенном уровне, обеспечивая состояние металло-лигандного гомеостаза.
Распределение того или иного катиона металла между биолигандами в биосредах определяется как прочностью образующихся комплексов, так и концентрациями этих лигандов. Для каждого из катионов биометаллов характерна своя совокупность реакций металло-лигандного равновесия. Поступление, метаболизм, накопление и выделение катионов металлов (а в целом любых микроэлементов) регулируются специальной системой микроэлементозного гомеостаза. В совокупности существуют тысячи патологических явлений - микроэлементозов, связанных с теми или иными металлоизбыточными или металлодефицитными состояниями. Нарушение металло-лигандного гомеостаза возможно по разным причинам: из-за дефицита или избытка катионов биометаллов, из-за поступления катионов токсичных металлов, из-за поступления или образования посторонних лигандов.
Для поддержания металло-лигандного гомеостаза и выведения из организма ионов токсичных металлов все шире начинают использовать комплексоны - полиаминополикарбоновые кислоты. В медицине сложилось специальное направление, связанное с использованием комплексонов для регуляции металло-лигандного баланса, - хелатотерапия.
Приведем примеры наиболее распространенных представителей комплексонов, применяемых в медицине.
Для того чтобы выполнять функцию противоядий (антидотов) при отравлении тяжелыми металлами, комплексоны должны отвечать некоторым требованиям. Они не должны, во-первых, быть токсичными, а во-вторых, подвергаться разложению или какому-либо изменению в биологической среде, их антидотное действие зависит от прочности образующегося металлокомплекса. Зная сравнительную устойчивость комплексов, можно
14
установить степень химического сродства отдельных катионов к тем или иным комплексонам, а значит, предвидеть возможность избирательного связывания. Необходимо учитывать, что эффективность комплексонов в отношении токсичных металлов зависит не только от стабильности образуемого комплекса металл-хелат, но и от прочности связи извлекаемого металла с биокомплексами организма.
С учетом этих требований наибольшее распространение в качестве антидотов получили различные соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), среди которых наиболее доступной является динатриевая соль, известная как трилон Б. Его применение показано при отравлении соединениями кальция: СаО (негашеная известь), Са(ОН)2 (гашеная известь), СаС2 (карбид кальция). При этом трилон Б, связывая ионы кальция, превращается в тетацин.
В организме комлексоны участвуют во многих сложных реакциях, вступая во взаимодействие с неорганическими биологическими соединениями. Так как в крови и других биосредах велика концентрация кальция, этот катион конкурирует с любыми из выводимых металлов за место в комплексе.
При этом положение равновесия комплексообразования в организме зависит от соотношения констант устойчивости комплексоната металла, выводимого из организма, и кальция (тетацина). Это становится очевидным из анализа следующего химического уравнения, которое должно иметь место в биосредах:
[CaЭДТА] + M2+ = [MЭДТА] + Ca2+
Для него константа равновесия KВ равна отношению констант нестойкости комплексов вытесняемого металла и кальция. KB называют константой вытеснения, а по величине ее отрицательного логарифма (pKB) судят о степени комплексообразования данного катиона с тетацином. Чем больше pKB , тем сильнее катион металла вытесняет катион кальция из тетацина.
Очевидно, что выведение из организма стронция не будет осуществляться кальциевой солью ЭДТА, а марганца и железа - ее кобальтовой солью. В соответствии с имеющим место рядом прочности хелатов тетацин обменивает ион кальция на ионы свинца, кобальта, кадмия. Отсюда следует ожидать, что тетацин должен быть эффективным антидотом при отравлении свинцом и кадмием, так как катионы этих металлов вытесняют из комплексона ион кальция, образующий менее прочный комплекс с ЭДТА. Он, таким образом, выглядит достаточно универсальным. Это в полной мере оказалось справедливым по отношению к иону свинца. К сожалению, величины pKB могут использоваться лишь для предварительной ориентировки, так как на практике более значимыми могут оказаться иные факторы.
15