Клубеньковые бактерии делят на пять родов: Azorhizobium, Rhizobium Mesorhizobium, Sinorhizobium (быстрорастущие) и Bradyrhizobium (медленнорастущие).
Клубеньковые бактерии – это грамотрицательные подвижные палочки. Они относятся к микроорганизмам, способным развиваться при низком парциальном давлении кислорода в среде. Оптимальная для роста клубеньковых бактерий температура 24–26 ºС. Клубеньковые бактерии в качестве источника углерода и энергии используют органические вещества, часто нуждаются в некоторых витаминах – тиамине, пантотеновой кислоте, биотине. Они обычно существуют свободно в почве, их количество зависит от характера почвы и ее предшествующей сельскохозяйственной обработки. При свободном существовании в почве используют связанный азот, т. е. утрачивают способность фиксировать азот атмосферы. Клубеньковые бактерии обладают выраженной специфичностью в отношении бобовых растений: каждый их вид вызывает образование клубеньков на корнях одного или группы близких видов бобовых.
Клубеньковые бактерии формируют симбиотические ассоциации с бобовыми растениями семейства Leguminosae, в котором выделяют три подсемейства — Mimosoideae, Papillonoideae и Caesalpinoideae. До 90% ви- дов первого и второго подсемейств и 23% видов третьего способны вступать в симбиоз с клубеньковыми бактериями. Клубеньковые бактерии характеризуются видовой специфичностью (избирательностью) по отношению к растению-хозяину. Определенный вид бактерий обычно образует клубеньки только на одном или нескольких видах бобовых растений. Так, Rhizobium leguminosarum инфицирует горох, вику, кормовые бобы и чечевицу; Rhizobium phaseoli — фасоль; Bradyrhizobium japonicum — сою; Bradyrhizobium lupini — лю- пин; Bradyrhizobium vigna — вигну, маш и арахис и т. д.
Внедрение клубеньковых бактерий в корень бобового растения-хозяина может осуществляться двумя путями: через верхушку корневого волоска или около его конца. У некоторых бобовых растений, например арахиса, бактерии проникают через «расщелины» в основаниях боковых ответвлений корня. При таком инфицировании растение может быть заражено большинством видов клубеньковых бактерий, и можно говорить о низкой специфичности данного бобового растения. Бобовые растения, инфицируемые через корневые волоски, проявляют обычно высокую специфичность в отношении вида клубеньковой бактерии-симбионта (Мишустин, Емцев, 2005).
Симбиоз устанавливается при прорастании семян бобовых растений. При их развитии корни выделяют органические питательные вещества, которые стимулируют размножение ризосферных микроорганизмов, в том числе и клубеньковых бактерий. Из почвы клубеньковые бактерии проникают через корневые волоски в корень. Процесс инфицирования начинается с адгезии клеток бактерий на поверхности корневых волосков. В клетках корневых волосков бобовых синтезируются особые вещества – хемоаттрактанты для бактерий. К таким соединениям, в частности, относятся флавоноиды и изофлавоноиды.
В корневой волосок проникает сразу несколько клеток клубеньковых бактерий. Проникновение сопровождается инвагинацией мембраны корневого волоска, образуется трубка, выстланная целлюлозой, вырабатываемой клетками хозяина. В этой трубке, называемой инфекционной нитью, находятся интенсивно размножающиеся бактерии. Инфекционная нить проникает в кору корня, проходя прямо через ее клетки, а не между ними. Развитие собственно клубенька начинается, когда инфекционная нить достигает тетраплоидной клетки ткани коры.
В молодых клубеньках большинство бактерий представляет собой палочковидные клетки, однако в дальнейшем они приобретают неправильную форму и становятся разветвленными, булавовидными или сферическими и называются бактероидами. На стадии бактероидов происходит фиксация молекулярного азота. В конце периода роста растения бактерии часто полностью исчезают из клубеньков; они отмирают, а вещества клеток поглощает растение-хозяин.
Эффективность азотфиксации определяется наличием у клубеньковых бактерий целого комплекса симбиотических признаков:
· вирулентности – способности клубеньковых бактерий входить в контакт с корневой системой бобовых растений, проникать в ткани корня, размножаться в них и индуцировать образование клубеньков;
Симбиотически фиксированный азот бобовых (Nф) определяется как разница между общим содержанием азота в бобовом растении (Nб) и суммой количества азота, поступившего в растение из удобрений (Nу), почвы (NП) и семян:
Nф = Nб – (Nу + NП + Nc).
Для определения показателя NП предлагается использовать зависимость между количеством почвенного азота, поступившего в растения (NП), запасом усвояемого азота почвы (АN) и коэффициентом использования растениями минерального азота удобрения (К). Эта зависимость выражается формулой
NП = АN * К/100.
Показатель АN устанавливается по методу изотопного разведения с помощью злаковой культуры, показатель К для бобовой культуры – изотопным методом. Допускается, что К одинаков как для азота удобрения, так и для азота почвы.
Обзор существующих методов определения размеров азотфиксации показывает, что все они страдают теми или иными существенными недостатками, затрудняющими в полевых условиях установить истинные величины вовлечения атмосферного азота в земледелие через культуру бобовых. Из четырех спряженных показателей азот в растениях – N общий, N удобрений, N почвы и N атмосферы – мы можем точно определить первые два. Главная трудность – в определении азота почвы. Наиболее доступным в полевых условиях является метод сравнения бобовых и злаковых культур по содержанию азота.
А) Создание оптимальных условий в почве для размножения и развития бактерий-азотфиксаторов. Сюда входят: изменение реакции среды до оптимальной за счет известкования, подбор необходимой структуры, либо улучшение ее за счет внесения органических удобрений, по возможности обеспечение почвы влагой в засушливых регионах, создание фона элементов питания, необходимых азотфиксаторам (в особенности по микроэлементам);
Б) Корректировка доз азотных удобрений с учетом азотфиксирующей способности бактерий. Как уже говорилось выше, внесение минерального азота способно существенно снизить или даже свести на нет биологическую фиксацию молекулярного азота атмосферы. Поэтому в ряде случаев возможен даже полный отказ от внесения азотных удобрений (например, под зерновые бобовые культуры)
Биологической альтернативой минеральным азотным удобрениям является биологическая фиксация молекулярного азота атмосферы. Биопрепараты на основе азотфиксирующих бактерий обладают широким спектром действия, их использование позволяет снизить норму минеральных азотных удобрений, что положительно сказывается на уровне нитратов и нитритов в продукции.
Биопрепарат ризотрофин на основе клубеньковых бактерий родов Rhizobium и Bradyrhizobium. Препараты клубеньковых бактерий сейчас широко используются во многих странах. Использование этих препаратов совершенно необходимо, когда в данной местности вводят новые культуры бобовых, и в составе флоры нет перекрестно заражающихся с ними растений.
Под бобовые растения применяется около 1,5 млн. га порций ризоторфина в год. Ризоторфин позволяет уменьшить объемы применения азотных удобрений; препарат разработан практически для всех бобовых, возделываемых в настоящий момент. Агрономическая эффективность ризоторфина для бобовых культур составляет в среднем 10-30%. При интродукции новых бобовых культур (люпин, люцерна, козлятник) эффективность бактеризации может составлять 50-100%, а сбор белка увеличивается в 2-3 раза (http://www.biotechnolog.ru).
Помимо ризоторфина существует ряд препаратов, созданных на основе свободноживущих бактерий-азотфиксаторов. Также разработаны препараты на основе культур цианобактерий, которые в основном применяются в тропических и субтропических зонах, а также на посевах риса, и препараты на основе ассоциативных азотфиксирующих бактерий (агрофил, мизорин, ризаргин, флавобактерин и др.)
Еще используют нитрагин - препарат, содержащий специально отселекционированные высокоактивные штаммы клубеньковых бактерий. Необходимость иннокуляции бобовых растений нитрагином объясняется следующими причинами. Бобовые культуры, впервые вводимые в той или иной зоне, вследствие узкой специфичности бактерий к растению-хозяину оказываются лишенными своего симбионта и не могут быть накопителями азота из атмосферы, а полностью переходят на питание азотом за счет почвы и удобрений. В таких случаях ннтратинизация - обязательный прием агротехники бобовых культур. Кроме того, длительное пребывание в почве клубеньковых бактерий без растения-хозяина, а также в неблагоприятных условиях среды (повышенная кислотность почвы, засуха или затопление, недостаток элементов минерального питания, источников энергетического материала и т.д.) приводит к снижению их азотфиксирующей активности. Целесообразность применения нитрагина вызвана еще и тем, что наряду с активными штаммами в почвах довольно широко распространены неактивные и малоактивные клубеньковые бактерии, которые не могут обеспечить бобовые растения биологическим азотом. Применение нитрагина, содержащего высокие титры активных селекционных штаммов клубеньковых бактерий, - один из главных приемов повышения не только урожайности бобовых культур, но и уровня накопления общего и биологически связанного азота в растениях и почве (Минеев, 2004).
Коэффициент азотфиксации (Кф) Хопкинса-Питерса получил широкое распространение, им часто пользуются для определения величины связывания атмосферного азота бобовыми. Умножив общее содержание азота в растениях на Кф, получают возможный размер азотфиксации. Однако к использованию этого коэффициента надо подходить с большой осторожностью, имея в виду, что он был получен при низких урожаях. В реальных условиях, как справедливо отметил А.В.Соколов (1957), использование азота воздуха может составлять как больше, так и меньше двух третей общего азота бобовых. При известковании кислых почв, внесении фосфора и калия бобовые способны взять из воздуха более 2/3 усвоенного ими азота. Иные результаты могут быть при несоблюдении этих условий, слабом заражении клубеньковыми бактериями или без учета других факторов. Поэтому негативно следует рассматривать расчеты некоторых авторов, сделанные по результатам длительных (севооборотных) опытов, когда количество фиксированного из атмосферы азота однолетними и многолетними бобовыми определяется по коэффициенту 0,65 для любой системы удобрения и без удобрений. Обогащение же почвы атмосферным азотом No вычисляется по коэффициенту 0,35 по формуле:
No = Nk – (1/3 NB + 1/3 Nk),
где Nk – количество общего азота в пожнивных и корневых остатках, NB – вынос азота надземной частью урожая.
Величина азотфиксации Nф этим методом определяется по формуле:
Nф = NИ – NН,
где NИ – общий азот инокулированного растения (г/сосуд, кг/га), NН – общий азот неинокулированного (безклубенькового) растения (г/сосуд, кг/га).
Сущность метода сводится к определению разницы между общим содержанием азота в растениях (Np), включая корни, и количеством его, взятым из почвы (NП), удобрения (Nу) и семян Nc:
Nф = Np – (NП + Nу + Nc),
где Nф – азот, фиксированный из атмосферы.
Количество почвенного азота, использованного растениями, включая азот удобрения, определяется по общей убыли азота в почве за период вегетации бобовых. Допускается, что азот семян используется практически полностью.
В основе метода лежит допущение, что бобовые берут из почвы столько азота, сколько его образуется в виде нитратов на парующих площадках, выделенных в посевах этих культур (или в сосудах с почвой без растений), с учетом поправки на содержание нитратов на площадках, занятых растениями. Учтенное количество азота нитратов в почве вычитается из общего содержания азота в растениях. Полученная разность и характеризует величину азотфиксации.
Принцип метода базируется на предположении, что при идентичных условиях выращивания определенных видов бобовых и злаковых культур количество взятого ими азота почвы примерно одинаково. Отсюда величина азотфиксации Nф легко определяется по разности:
Nф = (Nб – Nc) – (Nз – Nc),
где Nб – общий азот бобового растения, Nз – общий азот злакового растения, Nc – азот семян.
Принцип метода основан на способности клубеньковых бактерий восстанавливать не только молекулярный азот, но и ряд других соединений, в частности ацетилен (С2 Н2) до этилена (С2 Н4). При этом установлено, что количество образовавшегося этилена за еденицу времени находится в соотношении с количеством фиксированного азота, равным 3:1. Определив количество этилена на газовом хроматографе, и используя указанное соотношение, находят количество фиксированного азота.
· азотфиксирующей активности – способности связывать азот атмосферы при помощи специальной ферментативной системы и превращать его в ионы аммония;
· эффективности – способности увеличивать урожай и содержание белка у бобового растения-хозяина за счет передачи растению фиксированного азота и синтезированных биологически активных веществ;
· конкурентоспособности – способности внесенного в почву определенного штамма клубеньковых бактерий образовывать клубеньки в присутствии других штаммов того же вида;
· специфичности – способности вступать в эффективный симбиоз с определенным набором сортов и видов бобовых растений.
Значение клубеньковых бактерий в сельском хозяйстве очень велико. За вегетационный период на 1 га поля, засеянного многолетними бобовыми растениями (клевер, люцерна), связывается 150–200 кг атмосферного азота. Часть его выделяется из клубеньков во время вегетации, в основном в виде аминокислот. Остающиеся после уборки урожая корни, особенно у многолетних бобовых, содержат также много азота. Эти остатки подвергаются аммонификации, благодаря чему происходит обогащение почвы доступными для растений соединениями азота. Для обогащения почвы клубеньковыми бактериями в промышленных масштабах производятся препараты нитрагин, ризоторфин и сапронин, которые используются для предпосевной обработки семян бобовых.
Все бобовые культуры охотнее используют минеральные формы азота, чем азот воздуха. Однако азотные удобрения угнетают азотфиксацию тем сильнее, чем выше норма азота. При благоприятных условиях симбиоза под зерновые бобовые культуры не следует вносить азотные удобрения, а под многолетние бобовые травы – лишь в качестве «стартовых» доз перед посевом, и в качестве подкормки на второй год выращивания (Лысак, 2007).