Материал: Курсовая по микробиологии

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

«РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ –

МСХА имени К.А.Тимирязева»

(ФГБОУ ВО РГАУ – МСХА имени К.А.Тимирязева)

Кафедра микробиологии и иммунологии

КУРСОВАЯ РАБОТА

по дисциплине: ПОЧВЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

на тему: «Роль биологического азота в азотном балансе почв»

Выполнила:

студентка 201 группы

Проверила:

доцент Карепина Т. А.

Москва 2015

Аннотация

Тема курсовой работы «Роль биологического азота в азотном балансе почв». В данной работе рассмотрены вопросы о механизме фиксации азота бактериями азотфиксаторами, разновидность этих бактерий и значение их для сельского хозяйства, методы исследования азотфиксации и пути повышения эффективности азотфиксации. В практической части представлены результаты учета численности микроорганизмов в почве на различных плотных питательных средах. Взятый образец почвы был чернозем типичный.

Работа состоит из 49 страниц, 6 рисунков и 12 таблиц.

Содержание

Аннотация 2

I.Теоретическая часть 5

Введение 5

1.Биологическая и абиологическая фиксация азота 5

2.2 Значение других видов бактерий в накоплении азота в почве 12

3.Ассоциативные азотфиксирующие бактерии и их роль в обогащении почвы азотом 15

4.Клубеньковые бактерии и их значение для сельского хозяйства 17

5. Методы исследования биологической азотфиксации 21

5.1 Метод расчета по коэффициентам 21

5.2 Метод инокуляции (посев живых организмов в среды, организмы растений и животных). 21

5.3 Метод баланса 22

5.4 Метод парующих площадок 22

5.5 Метод сравнения с небобовыми растениями 22

5.6 Ацетиленовый метод 22

5.7 Метод с использованием меченого азота 23

6. Пути повышения эффективности биологической азотфиксации 24

6.1 Агротехнические мероприятия 24

6.2 Применение бактериальных препаратов в земледелии 24

Заключение 26

II.Практическая часть 27

1.Объект исследований 27

2.Отбор образцов почвы  28

3.Определение влажности 29

4.Метод учёта численности 30

5.Методы посева 31

6.Используемые питательные среды для количественного и качественного анализа микроорганизмов 32

7.Учет численности микроорганизмов на плотных средах 33

7.1Количественная и качественная оценка микроорганизмов на МПА 33

7.2 Количественная и качественная оценка микроорганизмов на СА 36

7.3 Количественная и качественная оценка микроорганизмов на среде Ваксмана 38

7.4 Количественная и качественная оценка целлюлозоразлагающих микроорганизмов на среде Гетчинсона 39

7.5 Количественная и качественная оценка микроорганизмов на среде Эшби 42

7.6 Общая численность групп микроорганизмов в черноземе типичном 44

Выводы к практической части 45

Список использованной литературы 46

Примечание 47

1. Теоретическая часть Введение

Азот- один из важнейших элементов в природе и его роль в жизни на Земле очень велика. Основная масса азота на Земле находится в газообразном состоянии и составляет свыше ¾ атмосферы. Это 78,09% по объему или 75,6% по массе. Практически запас азота нашей планеты неисчерпаем.

Никакой элемент не ограничивает ресурсы питательных веществ в агросистемах, как азот. Азотные вещества составляют существенную часть пищи для человека и животных. Так же азот нужен и растениям. Только человек и животные получают азотные органические вещества (белковые), а растения поглощают неорганические азотные вещества, извлекая их из почвы. Представители животного и растительного мира не могут черпать азот непосредственно из атмосферы воздуха. Такой способностью обладает ограниченное количество видов микроорганизмов и синезеленых водорослей, которые называют азотфиксаторами, а процесс связывания азота атмосферы этими организмами – биологической азотфиксацией.

1. Биологическая и абиологическая фиксация азота

Азот является одним из самых важных минеральных элементов, поглощаемых растениями. Ведь он является органогеном, то есть входит в состав белков, нуклеиновых кислот, витаминов и АТФ, необходимых для построения тела растений и осуществления различных жизненных функций. К сожалению, атмосфера Земли на 77% состоит из молекулярного азота, а для большинства растений он совершенно недоступен, растения могут усваивать азот только в виде нитрат-ионов и аммонийных катионов.

Азот, который поступает в растение и включается в состав белков, нуклеиновых кислот и других компонентов клеток в результате связывания микроорганизмами, носит название «биологический», а сами микроорганизмы, фиксирующие молекулярный азот атмосферы, — азотфиксаторами, или диазотрофами, т. е. использующими как N2, так и связанные формы азота (Мишустин, Емцев, 2005).

Диазотрофы - микроорганизмы, способные восстанавливать молекулярный азот атмосферы, переводя его в доступную для растений  форму. Другие - выбрали путь, который называют "уклоняющиеся типы азотного питания". Это паразиты и полупаразиты, поселяющиеся на других растениях, либо растения-хищники.

Молекула азота, находящегося в атмосфере в виде газа, состоит из 2 атомов азота (N₂), соединенных тройной связью. Молекулярный азот химически инертен, и у растений нет механизмов, которые могли бы разорвать эту прочную связь. Зато диазотрофы таким инструментом обладают. Они вырабатывают особый фермент - нитрогеназу. Нитрогеназа состоит из нескольких белковых субъединиц, в состав которых также входят атомы железа и молибдена. Этот фермент находится в мембранах клеток микроорганизмов. Фермент восстанавливает молекулярный азот до аммиака. Аммиак в  водной среде находится в виде катионов аммония, которые уже могут поступать в корни растений.

Характер взаимоотношений диазотрофов с растениями различен. Некоторые, например клубеньковые бактерии из рода Rhizobium проникают через корневые волоски в корневую систему растения и стимулируют деление тетраплоидных клеток корня, приводящее к образованию клубенька. В нем происходит интенсивное размножение бактерий. В молодых клубеньках большинство бактериальных клеток имеют форму палочек. В процессе последующего развития наблюдается образование клеток неправильной формы (бактероидов), в которых и происходит активная фиксация N2. Некоторые бактерии предпочитают обитать в прикорневой зоне, создавая ассоциациатичные связи с корнями, например азоспириллы (что чрезвычайно полезно для растений семейства злаковых). Особое место в проблеме фиксации атмосферного азота отведено цианобактериям. Они могут жить как самостоятельно, так и в симбиозе с другими организмами - лишайниками, папоротниками и т.д.

Термином “биологическая фиксация азота” подчеркивается, что мы имеем дело с уникальным биологическим явлением. Свой вклад в фиксацию азота воздуха вносят и иные (небиологические) процессы, такие, как грозы, извержения вулканов, воздействие УФ-лучей, пожары, сжигание топлива на тепловых электростанциях и в двигателях, наконец, производство аммиака по технологии лауреатов Нобелевской премии Фрица Габера и Карла Боша [1,2]. Но они составляют лишь 5%, следовательно, свыше 90% всей фиксации молекулярного азота атмосферы осуществляется в результате метаболической активности микроорганизмов (Гусев, Минеева 2003).

Согласно последним оценкам, микроорганизмы на земном шаре ежегодно фиксируют 175—190 млн т молекулярного азота в наземных экосистемах, из которых 99—110 млн т — на почвах сельскохозяйственных угодий. Ежегодное производство минеральных удобрений в мире достигло 60—70 млн т; кроме того, в составе органических удобрений на поля вносится около 15 млн т азота.

Азотфиксация является процессом восстановления атмосферного азота до аммиака, которой становится доступным для растений (Игнатов 1998).

Реакцию восстановления молекулярного азота до аммиака катализирует фермент нитрогеназа. Синтез нитрогеназы детерминируют nif-гены (от англ. nitrogen fixation), которые находятся в хромосоме (Klebsiella, Bradyrhizobium ) или мегаплазмиде (Rhizobium). Кроме nif-генов в азотфиксации участвуют продукты fix -генов. Известны три типа ферментов нитрогеназ. Наиболее распространенный тип содержит молибден, в других типах этого фермента вместо молибдена присутствует ванадий или железо. Некоторые азотфиксирующие бактерии в зависимости от наличия в среде молибдена или ванадия способны синтезировать два или даже три (Azotobacter sp. ) типа нитрогеназ. Все типы нитрогеназ состоят из двух белковых компонентов.

Компонент 1 – это собственно нитрогеназа, или MoFe-белок (динитрогеназа, или молибдоферредоксин); компонент 2 – это редуктаза динитрогеназы, или Fe-белок (FeS-белок, или азоферредоксин). MoFe-белок (мол. масса примерно 240 кДа) состоит из четырех субъединиц двух типов, т.е. представляет собой α2β2-тетрамер. Этот тетрамерный белок связан с MoFe-кофактором, выполняющим роль каталитического сайта восстановления N2. Fe-белок – гомодимер, состоящий из двух идентичных субъединиц, α2 – димер (мол. масса примерно 60 кДа), соединенных через [Fe4S4]-центр. Fe-белок принимает электроны от восстановленного ферредоксина или флаводоксина и передает их на MoFe-белок в АТФ-зависимой реакции.

Фермент нитрогеназа высокочувствителен к молекулярному кислороду – он инактивируется на воздухе и в аэробных условиях его синтез прекращается. Таким образом, фиксация азота представляет собой строго анаэробный процесс. Поэтому чувствительность нитрогеназы к О2 не затрудняет осуществление азотфиксации у строгих анаэробов, но является лимитирующим фактором в случае аэробов и факультативных анаэробов (Умаров, 1986).

2. Свободноживущие азотфиксирующие бактерии и их роль в обогащении почвы азотом

2.1 Значение азотобактера и бактерии рода Clostridium в пополнении азотного фонда почвы

Род Clostridium. Первым из свободноживущих азотфиксаторов был открытый С. Н. Виноградским в 1893 г. Clostridium pasteurianum. Это анаэробная бактерия, вызывающая маслянокислое брожение; имеют палочковидные клетки длиной 1,5—8 мкм и шириной 0,8—1,3 мкм. Молодые клетки несут жгутики, в старых образуются споры. При спорообразовании клетки утолщаются посередине или на конце. В присутствии кислорода воздуха С. pasteuriаnum может развиваться только при наличии в среде аэробных бактерий, поглощающих кислород.

Источником азотного питания для бактерий рода Clostridium могут служить соли аммония, азотной кислоты и многие содержащие азот органические соединения. При отсутствии указанных соединений бактерии усваивают молекулярный азот. Источником углерода для С. pasteurianum может быть широкий набор углеродсодержащих соединений — моносахариды, дисахариды, некоторые полисахариды (декстрин, крахмал) и органические кислоты. Развиваясь на питательных средах, содержащих углеводы, С. pasteurianum разлагает их с образованием масляной и уксусной кислот, диоксида углерода и водорода. Освобождающаяся при сбраживании углеводов энергия частично идет на усвоение молекулярного азота атмосферы. С. pasteurianum обычно считался слабоактивным фиксатором азота. Пределом его активности было связывание 1—3 мг азота на 1 г сброженного сахара. Однако, используя питательные среды, наиболее отвечающие физиологическим потребностям С. pasteurianum, его активность удалось повысить до 10—12 мг азота на 1 г сброженного сахара, в некоторых случаях и более.

Способность фиксировать азот атмосферы свойственна и другим видам рода Clostridium (Cl. butyricum, Cl. acetobutylicum, Cl. pectinovorum, Cl. felsineum и т. д.). Эти бактерии близки в систематическом отношении к Cl. pasteurianum, но отличаются от него ферментативными свойствами. Так, Cl. acetobutylicum вызывает ацетонобутиловое брожение, Cl. pectinovorum может разлагать пектин и т. д. Отдельные виды Clostridium приурочены к определенным почвам (Гусев, Минеева, 2003).

Род Azotobacter. Голландский микробиолог М. Бейеринк [3] в 1901 г. открыл аэробную бактерию, также усваивающую молекулярный азот — Azotobacter chroococcum (сем. Azotobacteriaceae). Молодые клетки азотобактера представляют собой палочки размером 2—3 х 4— 6 мкм. Позже они превращаются в крупные кокки диаметром до 4 мкм. Кокковидные клетки обычно покрыты капсулой и содержат разные включения (жир, крахмал, поли-В-гидроксимасляную кислоту и др.). У кокковидных клеток некоторых видов азотобактера появляется толстая оболочка, и они превращаются в цисты. На одних питательных средах палочки быстро приобретают кокковидную форму, на других — лишь по истечении длительного времени. Палочковидные клетки азотобактера имеют жгутики и обладают подвижностью. При переходе палочек в кокки жгутики обычно теряются.

Из описанных видов азотобактера наиболее изучены: A. chroococcum, A. beijerinckii, A. vinelandii и A. paspali. Перечисленные виды различают по размерам и форме клетки, а также по некоторым другим признакам, в частности пигментации колоний. Так, колонии A. chroococcum имеют бурый, почти черный цвет, A. vinelandii выделяют желтый пигмент с зеленой флуоресценцией, A. paspali также продуцируют желтый пигмент. В почвах чаще всего встречается Azotobacter chroococcum. Все виды азотобактера являются аэробами (Теппер и др., 2004).

Источником азота для них могут служить соли аммония, нитриты, нитраты и аминокислоты. В отсутствие связанных форм азота азотобактер фиксирует молекулярный азот. Небольшие дозы азотсодержащих соединений не приводят к депрессии фиксации азота, а иногда даже стимулируют ее. Увеличение количества связанного азота в среде полностью подавляет усвоение молекулярного азота.

Энергия усвоения азота у отдельных культур азотобактера колеблется в широком диапазоне. Активные культуры связывают 15—20 мг азота на 1 г потребленного органического вещества. Азотобактер способен использовать большой набор органических соединений — моно- и дисахариды, некоторые полисахариды (декстрин, крахмал), многие спирты, органические кислоты, в том числе ароматические. Для роста бактерии нуждаются в элементах минерального питания, особенно в фосфоре и кальции. Потребность азотобактера в данных элементах столь значительна, что его используют как биологический индикатор на наличие фосфора и кальция в почве. Для энергичной азотфиксации микроорганизмам требуются микроэлементы, из них наиболее важен молибден, который входит в состав ферментов, катализующих процесс усвоения азота.