Материал: кафедральные лекции
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ПЕРМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА Е.А. ВАГНЕРА МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РОССИИ»
ОБЩАЯ И ЧАСТНАЯ ГИСТОЛОГИЯ
Курс лекций
Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для студентов медицинских вузов
Пермь 2017
УДК 611-018
ББК 25.86
Ч52
Ч52 Общая и частная гистология: курс лекций / В.А. Четвертных, Е.А. Березина, Н.И. Гуляева, О.В. Лебединская; ФГБОУ ВО «ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера»; под редакцией проф. В.А Четвертных. – Пермь, 2017. – 151 с.
Кратко изложен лекционный материал, предлагаемый студентам первого и второго курсов Пермского государственного медицинского университета при изучении гистологии.
Лекции предназначены для студентов всех факультетов медицинского вуза, а также могут быть использованы студентами иностранного отделения.
Издание второе, исправленное и дополненное с учетом гистологической номенклатуры 2011 г.
Рецензенты: проф. Г.С. Соловьев, зав. каф. гистологии Тюменской медицинской академии;
проф. Г.Г. Егорова, зав. каф. анатомии сельскохозяйственных животных с курсом гистологии Пермской государственной сельскохозяйственной академии им. Д.Н. Прянишникова
Печатается по решению центрального координационно-методического совета ФГБОУ ВО «ПГМУ им. ак.
Е.А. Вагнера» Росздрава
УДК 611-018
ББК 25.86
©Четвертных В.А., Березина Е.А., Гуляева Н.И., Лебединская О.В., 2017
©ФГБОУ ВО «ПГМУ им. ак. Е.А. Вагнера» Росздрава, 2017
2
Лекция 1. МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА
Микроскопическая техника – это техника изготовления гистологического препарата и работы с ним.
Можно проводить исследования живых клеток и тканей под микроскопом, но в гистологии чаще изучаются фиксированные клетки и ткани. Основной, наиболее часто используемый вид препарата – гистологический срез, толщина его для светового микроскопа должна быть 4–20 мкм. Чтобы получить такие тонкие срезы, можно либо заморозить ткань и получить криостатные срезы (crios – холод), либо пропитать материал (кусочек органа, ткань) плотной средой – парафином или целлоидином. Используют для изучения также мазок крови и лимфы, мазок – отпечаток, пленочный препарат и др. объекты.
Этапы изготовления гистологического препарата
1.Взятие материала. Для приготовления препарата берут свежий материал, кусочек ткани или органа вырезают острым скальпелем или бритвой; объем его не более 1 см3.
2.Фиксация. Взятый материал сразу фиксируют. Фиксация – обработка материала для предотвращения грубых посмертных изменений структуры тканей. При фиксации происходят необратимая коагуляция белков и другие сложные реакции. Способ и длительность фиксации зависят от задач исследования и особенностей объекта. Фиксаторы бывают простые, когда используется одно вещество (10% раствор формалина, спирт 96° или 100°), и сложные – смеси нескольких веществ (спирт-формол, жидкость Ценкера, в которой главное действующее вещество – сулема, ценкер-формол и др.).
Фиксатор должен быстро проникать в ткани и равномерно пропитывать их. Если он не мешает дальнейшей работе с препаратом, можно сразу переходить к заливке материала (например, после фиксации в 96- и 100градусном спирте). Если фиксатор дает осадок, осаждение кристаллов в материале (формалин, сулема), то после фиксации (чаще в течение 24 часов) его удаляют.
3.Промывка в воде. Для удаления фиксатора материал промывают в проточной воде в течение 24 часов.
4.Обезвоживание и уплотнение. Для того, чтобы удалить избыток жидкости, взятый материал выдерживают в спиртах возрастающей крепости: 50, 60, 70, 80, 90° – по 24 часа в каждом, а затем в 96° и 100° спирте – по 12 часов в каждом.
5.Заливка. Заливку материала проводят в легкоплавкий парафин (углеводород с температурой плавления 52–54°С) или целлоидин (динитрат клетчатки).
До заливки кусочки органов пропитывают жидкостями, которые служат растворителями парафина (ксилол, хлороформ) или целлоидина (смесь 100-градусного спирта с эфиром поровну). Процесс заливки в парафин короче (около 10 суток или менее того) и позволяет получать более тонкие срезы, однако заливка в целлоидин, которая продолжается более месяца, дает возможность получить срезы самых плотных тканей организма – сухожилий, связок, хряща и кости.
6.Приготовление срезов. Гистологические срезы получают с помощью микротома. При этом толщина парафиновых срезов 4–7 мкм, целлоидиновых и криостатных – до 20 мкм.
7.Окрашивание. Полученные на микротоме срезы окрашивают, что позволяет четко видеть под микроскопом тонкие структуры объекта. Под воздействием красителей происходят сложные химические и физические процессы (см. далее классификацию гистологических красок).
8.Заключение в бальзам. Окрашенные срезы заключаются на предметном стекле под покровное стекло в каплю прозрачной затвердевающей жидкости – канадский или пихтовый бальзам (смола канадской сосны или пихты, растворенная в ксилоле). Приготовленные таким образом препараты могут храниться долго.
Классификация гистологических красок
По происхождению выделяют краски:
-натуральные (растительного происхождения – например гематоксилин, и животного – кармин);
-синтетические (эозин, метиленовый синий и др.).
По pH среды окрашивания краски делят на три группы:
-кислые – эозин, пикриновая кислота, пикроиндиго, кислый фуксин и др.;
-основные – гематоксилин, кармин, сафранин, метиленовый синий, азур-2, тионин и др.;
-нейтральные – нейтральный красный и др.
По окрашивающимся структурам различают краски:
-ядерные – это группа базофильных красителей;
-цитоплазматические – это кислые краски;
-специальные, избирательно окрашивающие определенные структуры или вещества. Примеры действия некоторых специальных красок:
-нервные элементы окрашиваются метиловым синим в синий цвет, а при импрегнации азотнокислым серебром становятся темно-коричневыми;
-жир и липиды окрашиваются суданом-3 в оранжевый цвет, а осмиевой кислотой – в черный;
-эластические волокна окрашиваются орсеином в темно-коричневый или черный цвет, а резорцинфуксин Вейгерта придает им темно-синюю окраску;
-гликоген окрашивается кармином Беста в лиловый цвет.
Те структуры препарата, которые окрашиваются основными красителями, называют базофильными, а те, которые окрашиваются кислыми красками – оксифильными.
Чаще всего используют окраску гематоксилином Бемера и 1–2% раствором эозина. При этом ядра клеток окрашиваются гематоксилином в синий или фиолетовый цвет, а цитоплазма – эозином в розовый.
3
Особенности приготовления препаратов для электронной микроскопии
В электронном микроскопе вместо светового луча, позволяющего получить максимальное увеличение в 1500 раз или немного больше, используется пучок электронов, обеспечивающий увеличение в десятки тысяч раз. Основные принципы изготовления препарата при этом те же, что и при световой микроскопии, а главные отличия таковы:
1.Из органа вырезают кусочек размером около 1 мм3.
2.Используют особые фиксаторы, в частности, глютаральдегид (для белков), затем проводят дофиксацию в 1% растворе четырехокиси осмия (для фосфолипидов).
3.Промывают материал в буферном растворе с ph 7,3–7,4.
4.Обезвоживание выполняют обычным способом.
5.Заливку проводят в еще более плотные среды – в специальные синтетические смолы, например эпоксидные: эпон + аралдит, которые затвердевают при полимеризации.
6.Полутонкие (1–2 мкм) и ультратонкие срезы (40–80 нм) получают на ультрамикротоме под контролем микроскопа.
7.Срезы переносят на металлические сеточки и вместо окрашивания контрастируют солями тяжелых металлов (свинца, вольфрама), часто используют уранилацетат.
8.Изображение участка препарата получают на флюоресцирующем экране, с которого делают фотографии – электронные микрофотографии (электронограммы).
Таким образом, электронномикроскопическая фотография препарата – второй объект для изучения студентами,
наряду с препаратом для световой микроскопии.
В гистологии для решения специальных вопросов используются разнообразные методы исследования: гистохимия, радиоавтография, люминесцентная, фазово-контрастная, ультрафиолетовая микроскопия; морфометрия, т.е. измерение различных структур клеток и тканей, в том числе с использованием автоматизированных систем обработки изображений световой и электронной микроскопии с помощью компьютера. Краткая характеристика этих методов изложена в учебнике гистологии.
Лекция 2. ЦИТОЛОГИЯ. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ ТКАНЕЙ
Цитология – наука о клетке, об общих закономерностях, присущих клеточному уровню организации живой материи.
Клетка – основная наименьшая единица живой материи, состоящая из ядра и цитоплазмы и обладающая основными свойствами «живого»: обменом веществ и энергии, способностью расти, дифференцироваться, отвечать на раздражение извне, самовоспроизводиться.
Цитоплазма клетки включает в себя прозрачную бесструктурную гиалоплазму, органеллы, или органоиды – живые и активно работающие части клетки, и включения, представляющие собой продукт жизнедеятельности клетки, пассивный запас каких-либо веществ.
Цитоплазма отделена от окружающей клетку среды и от соседних клеток цитолеммой.
Ядро имеет в своем составе ядерную оболочку, хроматин, ядрышко и кариоплазму (нуклеоплазму).
Цитолемма выполняет разграничительную функцию и регулирует движение ионов и молекул в клетку и из клетки, а также участвует в процессах фагоцитоза, пиноцитоза и экзоцитоза. Цитолемма представляет собой элементарную биологическую мембрану, состоит из двойного слоя липидов и белков – интегральных, полуинтегральных и периферических (транспортных, или белков-переносчиков). Кроме того, с липидами и белками связаны молекулы углеводов, образуя с ними сложные соединения – гликолипиды и гликопротеиды. Они формируют надмембранный комплекс – гликокаликс, в составе которого есть структуры, способные специфически связывать определенные химические вещества и называемые рецепторами. С внутренней стороны мембраны располагается подмембранный (субмембранный) комплекс, включающий в себя микрофиламенты, микрофибриллы и микротрубочки цитоскелета, а также актомиозиновый комплекс.
Специализированными структурами цитолеммы являются различные типы межклеточных соединений, а также выросты цитоплазмы – микроворсинки или более сложные по строению реснички и жгутики.
Различают следующие типы межклеточных соединений: простые межклеточные соединения (зубчатые и пальцевидные); пятна сцепления, или десмосомы; плотные соединения; пояски сцепления, или лентовидные десмосомы; щелевидные соединения, или нексусы, в области которых из клетки в клетку могут проникать небольшие молекулы и ионы, но не белки. По нексусам может передаваться возбуждение в сердечной или гладкой мышечной ткани. Синаптические соединения, или синапсы, характерны для нервной ткани, обычно они осуществляют одностороннюю передачу возбуждения или торможения между клетками.
Система биологических мембран клетки включает не только цитолемму и кариолемму (в составе последней имеются две биологические мембраны и между ними – перинуклеарное пространство), но и группу органелл мембранного строения: эндоплазматическую сеть, комплекс Гольджи, митохондрии, лизосомы и пероксисомы.
Все мембраны клетки по особенностям строения и функции разделяются на два подтипа:
-экзоплазматические мембраны, экзомембраны, к которым относят цитолемму, мембраны вокруг пузырьков при фаго- и пиноцитозе, внутреннюю мембрану митохондрий, внутреннюю мембрану ядерной оболочки, гранулярную эндоплазматическую сеть, мембраны лизосом и часть мембран комплекса Гольджи – все это мембраны с плотной упаковкой молекул более сложного состава, с непластическими, консервативными свойствами, т.е. не способные превращаться друг в друга или в эндомембраны;
-эндоплазматические мембраны, или эндомембраны, – все остальные мембраны клетки с пластическими свойствами, способные при необходимости превращаться в экзомембраны, усложняя свое строение.
4
Обычно в нормально функционирующей зрелой клетке общее количество мембран относительно постоянно, хотя структура и соотношение органелл могут меняться.
Образование новых мембран в клетке идет с участием гладкой (липидная часть) и гранулярной (белковые компоненты) эндоплазматической сети. Это наблюдается после деления клетки, при повреждении (точнее, при восстановительных процессах после повреждения), при гипертрофии клетки.
Органеллы общего значения мембранного строения
Эндоплазматическая сеть (ЭПС) – система канальцев и уплощенных цистерн. ЭПС, к наружной поверхности которой прикреплены рибосомы, называется гранулярной, она способна к синтезу белка. Гладкая ЭПС не имеет рибосом и связана с метаболизмом (синтез и расщепление) углеводов и липидов. Здесь же возможен синтез стероидных гормонов, обезвреживание снотворных веществ и канцерогенов, депонирование ионов кальция (в мышечной ткани). ЭПС является не только системой синтеза, но и системой внутриклеточного транспорта, и в то же время ее элементы способны разделять клетку на компартменты – изолированные зоны, в которых одновременно могут протекать химически несовместимые реакции. Наконец, гладкую ЭПС можно рассматривать как запас готовых эндомембран для регенерации мембранных структур клетки, а оба типа совместно (гладкая + гранулярная ЭПС) – как центр новообразования мембран.
Комплекс Гольджи содержит расположенные друг под другом (стопкой) уплощенные цистерны с расширенными, утолщенными краями, а также микропузырьки, крупные вакуоли и секреторные гранулы. Функции органоида: упаковка, конденсация и выведение белковых секретов, участие в синтезе углеводов, гликопротеинов и гликозаминогликанов, образование первичных лизосом, участие в эндо- и экзоцитозе.
Лизосомы – органеллы с защитной и пищеварительной функцией, способные расщеплять своими ферментами вещества и структуры как эндогенного, так и экзогенного происхождения. Различают четыре основные формы лизосом:
-первичные, которые содержат запас гидролитических ферментов (гидролаз) в неактивной форме – «везикула Гольджи, транспортирующая лизосомные ферменты»;
-вторичные, или фаголизосомы, образующиеся при слиянии первичной лизосомы с фагосомой, содержимое которой начинает перевариваться;
-аутофагосомы, образующиеся в случае разрушения компонентов самой клетки (при этом подлежащий удалению органоид или его часть окружается мембраной и образуется аутофагическая вакуоль, которая сливается с первичной лизосомой);
-остаточные тельца, содержащие частицы непереваренного материала и удаляющие его из клетки экзоцитозом. Пероксисомы напоминают лизосомы, но вместо гидролаз содержат оксидазы и каталазу, способную разрушать
токсичную для клеток перекись водорода.
Митохондрии – органеллы различной формы и размеров, имеющие двухмембранное строение. Внутренняя мембрана образует кристы, увеличивающие ее площадь, полость внутренней камеры заполнена митохондриальным матриксом, в котором содержатся АТФ-сомы (комплексы ферментов фосфорилирования), кольцевидные молекулы митохондриальной ДНК, транспортные и информационные РНК, мелкие рибосомы и ферменты. Функции митохондрий: обеспечение клетки энергией, синтез АТФ, молекулы которого депонируются в митохондриях и тратятся по мере надобности; обеспечение внутриклеточного дыхания за счет постоянно протекающих окислительных процессов; автономный синтез белка, в основном включающегося в состав внутренней мембраны. Митохондрии, обладая относительной автономностью в клетке, способны делиться перетяжкой или фрагментацией.
Органеллы общего значения немембранного строения
Рибосомы – сложные гранулы рибонуклеопротеидов, в состав которых примерно поровну входят белки и молекулы РНК; каждая рибосома состоит из большой и малой субъединиц, а также имеет в своем составе аминоацильный, пептидильный и трансферазный центры. Функция рибосом – синтез белка. Обычно белок синтезируется не одной рибосомой, а их группой (полисомой), связанной через общую молекулу информационной РНК. Свободные рибосомы и полисомы чаще продуцируют белки для нужд самой клетки, а те, которые фиксированы на гранулярной ЭПС, синтезируют в основном белки, выделяемые клеткой «на экспорт».
Клеточный центр (центросома) – две центриоли, окруженные центросферой (светлой зоной), от которой радиально отходят тонкие фибриллы, формирующие астросферу. Центриоли – два цилиндра, лежащие под прямым углом друг к другу. Стенка цилиндра состоит из девяти триплетов микротрубочек. Формула центриоли 9×3+0, так как в центре цилиндра трубочки отсутствуют. Центриоли служат центрами формирования всех микротрубочек клетки: здесь происходит редупликация (удвоение) центриолей перед митозом; синтез микротрубочек ахроматинового веретена деления; здесь же образуются микротрубочки цитоскелета и микротрубочки аппаратов движения клетки – ресничек и жгутиков. Последние представляют собой выросты цитоплазмы, в которых находится система микротрубочек, состоящая из двух центральных и девяти пар периферических. Формула жгутика или реснички 9×2+2, в основании их – базальное тельце, представляющее собой видоизмененную центриоль. Микротрубочки построены из белка тубулина.
Микротрубочки и микрофибриллы цитоскелета связаны с поддержанием постоянства формы клетки, ее каркаса.
Классификация включений цитоплазмы, представляющих собой продукты жизнедеятельности клетки, содержит следующие основные группы:
-трофические – белковые, жировые, углеводные (например, гликоген);
-пигментные – меланин, липофусцин и др.;
-секреторные – биологически активные вещества, синтезированные клеткой;
5