измерение поглощения (или пропускания) при прохождении излучения через образец;
измерение излучения, отраженного или рассеянного от образца;
комбинация вышеуказанных способов.
Измерения всегда проводят относительно фона.
Измерение пропускания. Пропускание является мерой снижения интенсивности излучения при прохождении через образец. Этот принцип реализован в большинстве используемых спектрофотометров, и результат может быть представлен непосредственно в единицах пропускания (T) и/или оптической плотности (A). В качестве фона используют спектр воздуха или среды сравнения. Способ применим для твердых и жидких проб, в том числе для дисперсных систем. Специальной подготовки проб при измерении пропускания, как правило, не требуется. Для измерения спектра жидких образцов используют флаконы или кюветы с подходящей длиной оптического пути (обычно 0,5-22 мм), а также оптоволоконные датчики на пропускание. Диффузное отражение. В методе диффузного отражения измеряют коэффициент отражения (R), представляющий отношение интенсивности света, отраженного от образца (I), к интенсивности света, отраженного от фона, или обратную логарифмическую величину этого отношения (АR).
В качестве фона используют поверхность с высокой величиной R: пластины из золота, перфторированных насыщенных полимеров, керамические пластины и другие подходящие материалы. Способ используется для анализа твердых образцов с применением интегрирующей сферы или оптоволоконных датчиков, работающих в режиме отражения. В последнем случае, для воспроизводимости получаемых результатов, необходимо обеспечить стабильность условий проведения измерений, в частности относительную неподвижность датчика, степень нажатия и другие условия. Способ пропускания-отражения. Данный способ является комбинацией пропускания и отражения благодаря специальной конструкции кювет и датчиков, в которых излучение дважды проходит через образец, что позволяет анализировать образцы с низкой поглощающей и рассеивающей способностью.
В качестве фона используют спектр воздуха или среды сравнения.
Способ применим для жидких, в том числе негомогенных проб.
Для регистрации спектра исследуемый образец помещают в кювету с зеркалом или другим диффузным отражателем. Возможно использование оптоволоконного датчика, который погружают в образец.
Факторы, влияющие на результаты измерений.
Температура образца. Температура образца может влиять как на его пропускание, так и на его отражение. Контроль температуры важен при анализе термически лабильных объектов, в случае которых разница в несколько градусов может приводить к существенным спектральным изменениям: твердые образцы, содержащие воду, дисперсные системы, аморфные объекты и прочее.
Влага и остаточные количества растворителей. Наличие воды и остаточных количеств растворителей может оказать влияние на характер спектра и результаты анализа. Необходимость и условия высушивания должны быть указаны в частных фармакопейных статьях.
Толщина образца определяет степень пропускания. С увеличением толщины слоя наблюдается увеличение поглощения. Поэтому при сравнительных измерениях пропускания толщина образца должна быть одинаковой или учитываться. При измерении отражения толщина слоя не имеет принципиального значения, но нужно учитывать, что толщина слоя должна быть сопоставимой с глубиной проникновения луча в образец. В случае недостаточной толщины, за образцом ставится дополнительный рефлектирующий материал, например штамп с золотым покрытием.
Оптические свойства образца. При анализе твердых образцов необходимо обеспечивать максимально возможную однородность пробы, так как различия в плотности или размерах частиц сказываются на характере спектра. Спектры физически, химически или оптически гетерогенных образцов следует регистрировать либо с увеличенным размером пучка света, либо используя устройства, вращающие образцы во время измерений. При этом желательно проводить измерения каждого образца несколько раз с последующим усреднением спектров.
Полиморфизм. Разница в кристаллической структуре (полиморфизм) оказывают влияние на спектр, что позволяет отличать друг от друга кристаллические или аморфные формы на основании их БИК-спектра. При проведении анализа необходимо учитывать, эталонный спектр, какой кристаллической структуры (модификации) используется в методе анализа.
Возраст образцов. Свойства образцов могут изменяться во времени, и эти изменения могут обуславливать спектральные различия для одних и тех же образцов. Данные изменения должны быть учтены при построении калибровочных моделей, как для целей идентификации, так и для целей количественного анализа.
Идентификация.
Идентификация в БИК-спектрометрии основана на принципе идентичности спектров одного и того же вещества. Для проведения идентификации первоначально создают библиотеку эталонных спектров (далее по тексту "библиотека"), подбирают оптимальную математическую модель для обработки спектров и реализации алгоритмов их сравнения, то есть создают метод идентификации. Далее проводят валидацию библиотеки в совокупности с выбранной математической моделью (см. раздел "Валидация метода идентификации"). Идентификацию проводят путем сравнения спектра испытуемого образца со спектрами в библиотеке (см. раздел "Анализ данных"). Создание библиотеки спектров. Библиотека содержит совокупности спектров, несущие характеристическую информацию о каждом объекте анализа. Для каждой совокупности спектров при помощи соответствующих методов и алгоритмов определяют оптимальные параметры идентификации. Данные установки действительны для всей библиотеки. Для близких объектов, неразличимых при заданных установках, создаются подбиблиотеки, в которых могут быть использованы другие методы предварительной обработки спектров и алгоритмы анализа. Количество спектров в библиотеке не ограничивается, но при большом их количестве идентификация химически сходных веществ затрудняется. В библиотеку включают спектры веществ, соответствующих предъявляемым требованиям, подлинность которых подтверждена иными фармакпейными методами. Для учета возможных вариаций свойств каждого вида анализируемых объектов регистрируют спектры нескольких партий (серий). Регистрацию спектров проводят при соблюдении схожести условий измерений и первичной обработки, которые предварительно оптимизированы для всех анализируемых объектов и сохраняются постоянными при последующих измерениях. В библиотеку не включают спектры, являющиеся случайными выбросами. Методы предварительной обработки спектров. Рекомендуется предварительная обработка спектров с целью повышения информативности получаемых результатов и уменьшения влияния спектральных вариаций. Обработка первичных данных может включать вычисление первой или второй производной, векторную нормализацию, мультипликативную коррекцию рассеивания и другие методы, включая комбинированные. Следует учитывать, что математическая обработка может привести к потере информации или появлению ошибок-артефактов. Выбор математической модели и алгоритмов должен быть обоснован.
Анализ данных. Сравнение спектров испытуемых образцов при идентификации проводится с индивидуальными или усредненными спектрами в библиотеке, например, путем корреляционного анализа. Метод идентификации должен быть валидирован. Валидация метода идентификации призвана продемонстрировать его пригодность для предусмотренного анализа. Валидация метода предполагает проверку показателей специфичности и устойчивости. Специфичность показывает, что каждый объект, спектр которого содержится в библиотеке, будет положительно идентифицирован и будет отличаться от других объектов, при этом объекты, не включенные в библиотеку, идентифицируются отрицательно. Устойчивость показывает, что незначительные изменения условий (например, температура, влажность воздуха, вибрации, температура образца, степень уплотнения материала, глубина погружения зонда, толщина слоя и т. д.) не влияют на результаты и надежность идентификации.
Количественный анализ.
Разработка методики (калибровка). При разработке методики для количественного анализа (калибровки), изменения интенсивности поглощения или отражения в спектре коррелируются с изменениями свойств и/или состава веществ. При этом регистрируют спектры образцов с известными значениями их химического состава и/или их свойств, подтвержденными иными фармакопейными методами. Так как хемометрические алгоритмы не допускают экстраполяций, необходимо, чтобы область калибровочных концентраций была больше, чем ожидаемый диапазон анализируемых концентраций или свойств. Калибровочные образцы, по возможности, должны быть равномерно распределены внутри диапазона рабочих концентраций. Регистрацию спектров проводят при соблюдении параметров эксперимента, факторов, влияющих на результаты измерений и первичной обработки, которые предварительно оптимизированы для всех анализируемых объектов и сохраняются постоянными при последующих измерениях. В библиотеку не включают спектры, являющиеся случайными выбросами. Калибровочную модель оптимизируют при помощи подходящего способа предварительной обработки спектров, выбора спектральной области и математического алгоритма.
Методы предварительной обработки спектров. Проводят так же, как описано в разделе "Идентификация". Выбор математической модели и алгоритмов должен быть обоснован.
Анализ данных. Для калибровки может использоваться любой обоснованный математический алгоритм. Так как в области ближнего ИК-диапазона наблюдается сильное перекрывание полос поглощения, количественный анализ проводят с реализацией преимущественно хемометрических алгоритмов, например таких, как метод частных наименьших квадратов (МЧНК, англ. PLS), метода регрессии на главные компоненты (МРГК, англ. PCR) и других.
Валидация калибровочной модели. Валидация модели калибровки предполагает демонстрацию ее пригодности для решения поставленной задачи. При этом должны быть оценены такие показатели, как специфичность (селективность), линейность, рабочий диапазон концентраций (аналитическая область), правильность, прецизионность и устойчивость.
Для демонстрации специфичности существуют следующие подходы:
выбранный спектральный диапазон или полоса поглощения связана с анализируемым свойством объекта (например, концентрация, содержание влаги и т. д.) и коррелирует с фотометрической величиной;
демонстрируется, что изменения в составе плацебо в пределах рабочего диапазона концентраций не оказывают существенного влияния на результаты количественного измерения определяемого образца;
допускаются другие обоснованные подходы.
При валидации линейности должно быть показано, что результаты, полученные методом БИК с реализацией выбранного алгоритма обработки, сопоставимы с результатами, полученными другим стандартным методом. В качестве критерия приемлемости может быть выбран коэффициент детерминации (r2), коэффициент корреляции (r) или иной критерий, определяющий пригодность калибровочного метода. Диапазон рабочих концентраций определяет интервал, в котором соблюдаются заявленные валидационные показатели. Результаты испытаний, выходящие за пределы данного диапазона, являются неприемлемыми. Правильность методики должна доказывать отсутствие значимой систематической погрешности или обоснованность поправочных коэффициентов, вводимых в расчеты при ее наличии. Правильность оценивается путем сопоставления результатов, полученных с использованием модели калибровки и результатов, полученных стандартным методом. Прецизионность описывает степень рассеивания результатов анализа. При этом должна быть оценена как внутрилабораторная, так и межлабораторная прецизионность. Устойчивость методики количественного анализа показывает, что незначительные изменения условий не влияют на результаты количественного определения.
Выбросы. При анализе методом БИК следует учитывать, корректировать или обоснованно исключать резко выделяющиеся результаты как внутри рабочего диапазона, так и вне данного диапазона. Выбросы, находящиеся в пределах рабочего диапазона, подлежат дальнейшему исследованию и, в случае их информативной важности, могут быть включены в модель. Выбросы, находящиеся вне калибровочного диапазона, также подлежат анализу. Если полученные результаты подтверждены стандартным методом, спектры таких проб могут быть внесены в калибровочную модель с последующей ревалидацией метода.
Ревалидация. Прошедший валидацию и признанный пригодным для применения БИК-метод идентификации или количественного анализа нуждается в последующей периодической валидации (ревалидации). При установлении отклонений необходима корректировка метода. Необходимость ревалидации зависит от характера изменений.
БИК-метод нуждается в ревалидации, если:
в библиотеку добавляется новый объект (для качественного анализа);
есть предпосылки к изменению характеристик объектов, спектры которых уже включены в библиотеку (изменение технологии производства
(синтеза), состава, качества исходного сырья упаковки и т. д.);
обнаружены иные изменения и/или несоответствия в свойствах анализируемых объектов или методике.
Перенос методик. При переносе методик идентификации и количественного анализа с одного прибора на другой должны учитываться спектральные характеристики используемых спектрофотометров (разрешение, диапазон волновых чисел и др.). Спектрофотометры с высокой фотометрической точностью и точностью по волновому числу (например, Фурье-спектрофотометры), позволяют осуществить прямой перенос методов как качественного, так и количественного анализа без дополнительных манипуляций. Если прямой перенос невозможен, применимы различные математические способы для переноса моделей. После перенесения методов необходима их ревалидация.
Хранение данных. Хранение данных осуществляется в электронном виде в соответствии с требованиями программного обеспечения. При этом необходимо сохранять исходные спектры, не подвергшиеся математической обработке, с целью их возможного дальнейшего использования при оптимизации библиотек или методов [7].
Ряд исследований демонстрирует широкие возможности БИК-спектроскопии в
отношении установления подлинности фармацевтических субстанций и лекарственных
препаратов. Более того, в ряде случаев при соответствующей калибровке методик
возможно также и установление происхождения (производителя) ЛС. Одним из
основных преимуществ данного метода является практически отсутствующая
пробоподготовка. Более того, в ряде случаев субстанции и препараты можно
сканировать через упаковку. Диффузная отражательная спектроскопия в ближней
ИК-области спектра является уникальным физическим методом, позволяющим
осуществлять определение значительного числа показателей в продуктах сложного
химического строения. Приборы, основанные на этом методе (ИК-анализаторы) и
представляющие собой спектрометры нового поколения, являются наиболее
перспективными экологически безопасными приборами для экспрессного определения
широкого диапазона показателей качества пищевых и сельскохозяйственных
продуктов и материалов. Слабая абсорбция в ближней ИК-области и использование
диффузного отражения от анализируемой пробы делает возможным прямой анализ
продукта, что практически исключает сложную пробоподготовку и существенно
увеличивает измеряемые концентрации [10].
7. Cпектроскопия с преобразованием Фурье
Фурье-спектроскопия - метод оптической спектроскопии, позволяющий получать спектр в результате обратного Фурье-преобразования интерферограммы исследуемого излучения, зависящей от оптической разности хода двух лучей и представляющей собой Фурье-образ спектра (функцию распределения энергии излучения по частоте) [13].
Комплекс аппаратуры, выполняющий эти операции, называется Фурье-спектрометром (ФС). В него, как правило, кроме двухлучевого интерферометра входят осветитель, детектор излучения, усилитель, аналогово-цифровой преобразователь и ЭВМ.
Интерферометр содержит два взаимно перпендикулярных зеркала - неподвижное и подвижное, и полупрозрачную светоделительную пластину, расположенную в месте пересечения падающих пучков излучения и пучков, отраженных от обоих зеркал. Пучок излучения от источника, попадая на пластину, разделяется на два. Один из них направляется на неподвижное зеркало, второй - на подвижное зеркало; затем оба пучка, отразившись от зеркал, выходят через светоделитель из интерферометра в одном и том же направлении. Далее излучение фокусируется на образце и поступает на детектор излучения. Два пучка отличаются друг от друга оптической разностью хода, величина которой меняется в зависимости от положения подвижного зеркала. В результате интерференции пучков интенсивность результирующего светового потока периодически меняется (модулируется). Частота модуляции зависит от частоты падающего излучения и смещения подвижного зеркала [12].