В нормально-фазовой распределительной хроматографии используют следующие системы: полярный растворитель (вода, спирт) фиксирован на твердом носителе – силикагеле, диатомите, целлюлозе, оксиде алюминия. Полярной фазой в этом случае служат неполярные растворители – изооктан, бензол, и др.
В обращенно-фазовой распределительной хроматографии неполярный растворитель фиксируют на носителе, а в качестве подвижной фазы используют полярные растворители (вода, спирт, буферные растворы, сильные кислоты).
Нанесенные жидкие фазы имеют большой недостаток – они быстро смываются подвижной жидкой фазой с поверхности носителя, особенно, при использовании таких систем в ВЭЖХ, т. е. при повышенном давлении в колонке. Поэтому жидкие фазы прививают к носителю. В качестве носителей неподвижных жидких фаз для НФРХ используют силикагели с привитыми нитрильными, аминными и другими группами. В обращенно-фазовом варианте используют силикагели с привитыми алкилсилильными группами. Механизм удерживания на таких сорбентах сложен.
Метод распределительной хроматографии применяют для разделения сильнополярных соединений, аминокислот, фенолов, фенилкарбоновых кислот и др.
6.3. Эксклюзионная хроматография
Эксклюзионная хроматография – это разновидность жидкостной хроматографии, в которой разделение компонентов основано на распределении молекул в соответствии с их размером между растворителем, находящимся в порах сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами. В процессе разделения небольшие молекулы попадают в сетку полимера, в порах которой растворитель служит неподвижной фазой, и удерживаются там, большие молекулы не могут проникнуть в полимерную сетку и вымываются из колонки подвижной фазой. Вначале элюируются самые большие, затем средние и потом небольшие молекулы. Поэтому эксклюзионную хроматографию называют также молеку- лярно-ситовой. Эксклюзионная хроматография подразделяется на гельпроникающую и гель-фильтрационную. В гель-проникающей хроматографии разделение осуществляется на полимерах, набухающих в органических растворителях; если же полимеры набухают в воде, то говорят о гель-фильтрационном варианте.
Каждый сорбент характеризуется объемом пор, следовательно, областью разделяемых молекулярных масс и градуировочным графиком,
41
который имеет сложный вид, характеризующий зависимость удерживаемого объема от молекулярной массы или размера молекул. Надо подбирать сорбент и длину хроматографической колонки такими, чтобы разделение вещества протекало в пределах линейного участка градуировочного графика.
Неподвижные фазы в эксклюзионной хроматографии выбирают для конкретной аналитической задачи. Первоначально устанавливают, какая система растворителей может быть использована для анализа (водная или водно-органическая), что и определяет тип сорбента.
Подвижные фазы в эксклюзионной хроматографии должны удовлетворять определенным требованиям:
–полное растворение образца;
–хорошее смачивание сорбента;
–предотвращение адсорбции;
–низкая вязкость и токсичность.
Метод эксклюзионной хроматографии широко используют при исследовании полимеров, определении их молекулярных масс, а также в биологии и медицине для анализа белков, крови и других объектов.
6.4. Особенности жидкостных хроматографов.
Жидкостной хроматограф – более сложный прибор по сравнению с газовым. Это связано с тем, что система подачи элюента включает ряд дополнительных узлов: систему дегазации, градиентное устройство, насосы и измерители давления.
Градиентное устройство должно обеспечить отбор элюентов из двух-трех емкостей в смеситель, затем в колонку. Насосы должны иметь постоянную скорость потока от 0.1 до 10 мл/мин при давлении 400 атм. Кроме того, необходимо тщательное удаление газа из всех используемых растворителей, так как появление пузырьков газа в детекторе недопустимо. Проба вводится с помощью петлевых дозаторов или специальных микрошприцов через прокладку из специальных ненабухающих полимерных материалов.
ВВЭЖХ обычно используют прямые колонки длиной 10, 15, 25 см
свнутренним диаметром 4–5,5 мм. В микроколочных хроматографах используют колонки длиной 5–6 см и диаметром 1–2 мм. Колонки изготавливают из стекла или нержавеющей стали.
Вионном хроматографе все соединительные трубки, колонки, краны выполнены из химически инертных материалов, что позволяет использовать сильнокислотные и сильноосновные элюенты.
42
Для непрерывного контроля элюата, вытекающего из колонки, обычно используют дифференциальные рефрактометры, люминесцентные, УФ-спектрофотометрические и кондуктометрические детекторы.
Дифференциальный рефрактометр – это универсальный детектор, который позволяет определять общий показатель преломления системы проба– элюент, т.е. сигнал дают все компоненты, показатель преломления которых отличается от показателя преломления элюента. Чувствительность детектора – 10-6 г.
УФ-детектор работает при одной и той же длине волны, соответствующей наиболее интенсивной линии ртутной лампы низкого давления λ =253.7 нм. УФ-детектор наиболее чувствителен, если молярные коэффициенты светопоглощения компонентов высоки, а элюент не поглощает в ультрафиолетовой области спектра. С помощью такого детектора можно определять любые ароматические соединения, большинство кетонов и альдегидов. УФ-детектор селективен, чувствительность его составляет 10-9 г.
Фотометры и спектрофотометры позволяют работать при любой длине волны (190-650 нм). Регистрируют изменение поглощения во времени при определенной длине волны или в остановленном потоке элюента снимают спектр. Быстрозаписывающий спектрофотометр позволяет записать всю спектральную область за 20с.
Кондуктометрический детектор применяют в ионной хроматографии для измерения проводимости раствора, пропорциональной числу ионов в растворе, их подвижности. Предел обнаружения с помощью такого детектора составляет порядка 10-3 мкг/мл. Использование концентрирующей колонки позволяет снизить предел обнаружения на 2–3 порядка.
В эксклюзионной хроматографии при анализе полимеров для определения средних молекулярных масс используют проточный нефелометр.
Вопросы для самоконтроля
1.Какова роль подвижной фазы в жидкостной хроматографии?
2.Какими способами проба анализируемой смеси веществ вводится в хроматографическую установку в жидкостной хроматографии?
3.Какова роль основных узлов в жидкостном хроматографе высокого давления? Что общего и каковы принципиальные отличия от газового хроматографа?
4.Назовите три способы детектирования в жидкостной хроматографии.
43
5.Почему в жидкостной хроматографии предпочитают подвижные фазы с низкой вязкостью?
6.Какие варианты используются в жидкостно-жидкостной распределительной хроматографии?
7.Каковы особенности эксклюзионной хроматографии?
8.Как изменяется время (объем) удерживания молекул в эксклюзионной хроматографии с увеличением их размера?
9.Чем отличаются нормально- и обращенно-фазовый варианты ВЭЖХ?
44
ГЛАВА 2. ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Газожидкостная хроматография
Работа 1. Определение качественного состава смеси на основе
характеристик удерживания
Цель работы: Идентифицировать компоненты хроматографируемой смеси по объемам удерживания и для идентифицированных компонентов рассчитать удельные удерживаемые объемы.
Cущность работы: Газовая хроматография позволяет проводить индивидуальную и групповую идентификацию веществ (т.е. отнесение их к определенной группе соединений). Индивидуальную хроматографическую идентификацию проводят с помощью следующего приема: сравнивают характеристики удерживания компонентов анализируемой смеси с характеристиками удерживания стандартов, компонентов стандартных смесей или с табличными данными.
Характеристики удерживания
1. Расстояние удерживания lR , мм – расстояние от момента ввода пробы на хроматограмме до максимума соответствующего пика. l0 –
расстояние удерживания несорбирующегося компонента, мм, определяется от момента ввода пробы до максимума пика несорбирующегося компонента;
2. Исправленное (приведенное) расстояние удерживания, lR/ –
расстояние от вершины пика несорбирующегося компонента до максимума соответствующего пика, мм;
lR/ = lR − l0 |
(2.1) |
3. Время удерживания tR ,мин – |
время, прошедшее от момента |
ввода пробы в колонку до момента записи максимума соответствующего пика.
Время удерживания можно рассчитать, зная линейную скорость движения диаграммной ленты в потенциометре Uл, мм/мин:
45