Материал: Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии

Ridgwell и соавт. [565] клонировали фрагменты кДНК, соответствующие Rh-связанному­ гликопротеину, и выделили кДНК полной длины из библиотеки кДНК костного мозга человека. Полученный Rh-гликопротеин содержал 409 аминокислот и имел, подобно полипептидам Rh, 12 мембранных доменов с внутриклеточными N- и С-концевыми участками. Аминокислотная последовательность Rh-гликопротеина­ и Rh-полипептида различалась. Сходство ограничивалось двумя аминокислотными остатками в первом и пя-

том домене: Glu 13 и Glu 146 – в гликопротеине Rh, Glu 21 и Glu 146 – в по-

липептиде Rh [565].

Структура генов RH

В 1972 г. Ruddle и соавт. [587] удалось определить, что генный локус системы резус расположен на хромосоме 1. Затем он был картирован на коротком плече хромосомы в участке 1p34.3–p36.13 [211, 453, 462].

Когда была получена кДНК, соответствующая Rh-полипептидам, ее можно было использовать в качестве зонда в Саузерн-блоте для исследования геномной ДНК, т. е. определения структуры генов RH.

Результаты этих исследований подтвердили, что локус RH включает 2 очень похожих гена (СЕ и D), а один из этих генов отсутствует в гДНК, выделенной у нескольких неродственных лиц D − [233]. Таким образом была установлена молекулярная основа общего для европеоидов фенотипа Rh −, который часто обусловлен делецией гена D.

Ген D включает 10 экзонов и имеет организацию, похожую на структуру гена СЕ, но не идентичную ей (см. рис. 4.7).

Гены D и CE различаются по интрону 4 [138]. В гене СЕ имеется делеция 650 пар нуклеотидов, начинающаяся в интроне 4 от нуклеотида 181 [146]. Интрон 4 гена СЕ имеет 1976 пар нуклеотидов. Нуклеотиды в положении 1–181 и 831–1076 примерно идентичны в генах D и СЕ. Интрон 5 генов D и СЕ включает 1636 пар нуклеотидов. Имеется 29 нуклеотидных различий между этими двумя генами (98,2 % гомологии).

Организация гена СЕ исследована Cherif-Zahar и соавт. [209]. В связи с тем что антиген D обусловлен геном, отсутствующим у людей Rh −, определение молекулярной структуры антигенов Сс и Ее упростилось.

Mouro и соавт. [496] экстрагировали матричную РНК людей с редким фенотипом СсЕе и использовали синтетические олигонуклеотидные праймеры в присутствии обратной транскриптазы для получения кДНК полной длины, соответствующей продукту гена СЕ.

Присутствие антигенов Е и е было обусловлено заменой пролина на аланин в позиции 226. Пролин в этой позиции придавал субстрату специфичность Е, аланин – специфичность е (см. рис. 4.5).

При сравнении кДНК лиц, содержащих антигены C и c, ситуация оказалась сложнее. Наблюдали 6 различий в нуклеотидах, одна часть из кото-

181

рых (Cys 16, Ile 60, Ser 68, Ser 103) коррелировала с экспрессией C, другая

(Trp 16, Leu 60, Asn 68, Pro 103) – с экспрессией с (hr') [496]. Эта находка была подтверждена амплификацией гДНК от людей с известным фенотипом: экзон 1 и 2 кодировал остатки, специфичные для антигенов Сс, а экзон 5 – специфичные для антигенов Ее.

Cherif-Zahar и соавт. [208] высказали предположение, что, хотя антигены Сс и Ее являются продуктами одного и того же гена и кодированы одним видом мРНК, возможен альтернативный сплайсинг, формирующий несколько белков. Полипептид полной длины кодирует экспрессию антигенов Ее, а не Сс; сплайсеоформа, в которой отсутствует экзон 5, кодирует экспрессию Сс, но не Ее. Гипотеза подтверждается тем фактом, что из препаратов мРНК людей Rh − могут быть выделены разные продукты гена СЕ.

По мнению Umenishi и соавт. [666], сплайсеоформы не являются производными гена СЕ; они могут также происходить от гена D. Некоторые сплайсеоформы выделены из незрелых эритробластов.

В экспериментах Smythe и соавт. [618] антигены с и Е были получены de novo на поверхности эритроидных клеток K562, в которые был введен ретровирус, комбинированный с кДНК, соответствующей сЕ-экспрессии. Поскольку использованная кДНК была полной длины, это отчетливо подтвердило, что антигены с и Е находятся на одном и том же полипептиде.

Аминокислотная замена, определяющая Е- и е-специфичность [Pro 226 (антиген Е), Ala 226 (антиген е)], находится в четвертой внеклеточной петле полипептида СЕ. Эта локализация полностью соответствует серологическим различиям антигенов Е и е. Однако антигенные различия обусловлены не только аминокислотной заменой, но и соответствующим молекулярным окружением. Полипептид D также имеет остаток аланина в положении 226, но не несет е-антигенности.

Структура антигенов С и с сложнее, потому что полипептиды СЕ имеют 4 аминокислоты для антигена С и 4 – для антигена с, одна из которых [Ser 103 (антиген С) или Pro 103 (антиген с)] расположена на второй внеклеточной петле полипептида.

Три из четырех аминокислот (Ile 60, Ser 68, Ser 103), которые отличают С-активный полипептид от с-активного, обнаружены также в D-полипептиде. Эти 3 аминокислоты кодируются экзоном 2 гена СЕ и экзоном 2 гена D. Не исключено, что именно благодаря этому подобию антигенов D и C антитела анти-D могут содержать анти-С-специфичность даже в тех случаях, когда эритроциты, послужившие антигенным стимулом, не имели серологически выявляемого антигена С, т. е. это был «чистый D». Во многом идентичная топология полипептидов, кодируемых генами D и CE, лежит в основе перекрестных реакций антигенов и антител системы резус.

Считается, что гены RH синтезируют полипептиды, несущие Rh-антигены­ , не используя субстанций-предшественников.

182

Антиген D и его варианты

Антиген D (резус-антиген, резус-фактор, стандартный резус-антиген) после групповых антигенов А и В имеет наибольшее значение в трансфу­зиологии и акушерстве. Он присутствует у лиц с генотипом D / D и D / d. Как и другие Rhантигены, антиген D содержится в мембране эритроцитов. Со слюной он не выделяется и в других жидкостях и тканях организма не представлен. Лица, не содержащие антигена D, естественных антител против­ него, подобных групповым изогемагглютининам, не имеют.

Формирование эпитопов D кодируется экзонами 4 и 5 гена RHD. Avent и соавт. [143], Huang [355] считают, что конверсия генов в этих экзонах обусловливает крайне низкую экспрессию D-антигена.

Убольшинства людей D − имеется полная делеция гена RHD [138, 233, 368, 418, 616]. Соответствующего генетического эквивалента в виде d / d у них не найдено.

Вредких случаях у людей D − наблюдали частичную делецию гена RHD [146, 368, 512], особенно среди лиц с фенотипом Cde, cdE, имевших экзоны RHD-гена, которые не были функциональными.

Описаны лица D– с генотипом Cde / Cde, имеющие практически сохранен-

ный RHD-ген [137, 146]. У одного из этих лиц (рис. 4.8, строка Rо Har) полномерный ген RHD имел одну точку мутации С → Т в нуклеотиде 121, превращающую кодон глицина 41 в стоп-кодон [146]. Три другие мутации были обнаружены в RHD-транскриптах этого пробанда: в кодоне 215 – ТТС → СТС

(Phe → Leu), в кодоне 216 – TTG → CTG (Leu → Leu) и в кодоне 330 – TAC → CAC (Tyr → His).

Удругого человека было выпадение 4 нуклеотидов в секторе экзона 4 [137], что, как полагают авторы, могло привести к повреждению считывания нормального гена, в результате чего ген не проявлял себя фенотипически.

Иммунодоминантные протеины D + и D − отличаются 36 аминокислотными заменами, из которых 8 расположены на внеклеточных гидрофильных­ петлях протеина в позиции 169, 170, 172, 233, 238, 350, 353, 354. Эти замены с их моле-

кулярным окружением, по-видимому, и являются D-несущими­ детерминантами, способными связываться с анти-D-антителами.

Green [319], Le Van Kim и соавт. [418], Schmitz и соавт. [600] полагали, что экспрессию антигенов D, C и с обусловливает цистеиновый остаток, расположенный экзофациально в позиции 285.

Suyama и соавт. [646] не разделяли эту точку зрения, предположив, что Cys 285 не является определяющим в экспрессии антигена D.

Smythe и соавт. [618] применили трансфекцию генов RH в клетки K562, чтобы экспрессировать антигены Rh. В некоторые клетки К562 вводили мутантный ген D, кодирующий в позиции 285 аланин вместо цистеина. Трансфектные клетки экспрессировали одно и то же количество D-анти­гена независимо от того, что кодировала вживляемая кДНК в позиции 285 – цистеин или аланин.

183

Рис. 4.8. Гибридные гены парциальных антигенов D. Темные прямоугольники – экзоны гена RHD, светлые прямоугольники – экзоны гена RHCE. Буквами справа обозначен антигенный комплекс, кодируемый данным геном.

Экспрессия антигена D

Выраженность антигена D на эритроцитах не является константной величиной и меняется в широких пределах: от очень сильной до очень слабой, с трудом выявляемой. Во многом она зависит от сочетания факторов Rh, имеющихся у человека.

Считается, что отсутствие одних антигенов Rh сопровождается повышенным синтезом других, чтобы обеспечить формирование полноценной клеточной мембраны. Так, в отсутствие полипептидов, несущих антигены Сс, ген RHD производит дополнительное число полипептидов D, восполняя таким образом нехватку структурных элементов в мембране клетки. Высказывалось предположение, что сильный D-антиген на таких клетках обусловлен отсутствием конкуренции генов Сс и Ее в освоении общей для них и гена D субстанциипредшественника. При делеции гена D компенсаторную функцию берут на себя гены RHCE, нарабатывая большее, чем обычно, количество СЕ-полипептидов.

184

Имеются и другие предположения относительно неодинаковой экспрессии антигена D у разных индивидов, например CDe и cDE. В частности, полипептиды Се и се, переплетающиеся в оболочке эритроцита с полипептидами D, затрудняют доступ анти-D-антител к участкам D-антигена, в результате чего создается видимость слабого реагирования эритроцитов D + с анти-D- сыворотками. При отсутствии полипептидов Се и се в оболочке эритроцитов связыванию D-антигенов с анти-D-антителами ничто не мешает, и реакция выглядит более сильной, хотя на тех и на других эритроцитах могло присутствовать одинаковое количество антигенных детерминант. Полипептиды­ сЕ в меньшей степени блокируют доступ антител к D-антигену, чем белки, несущие Сеантигены, вследствие чего антиген D выражен сильнее, когда он находится в комбинации с антигеном сЕ, и менее выражен – в комбинации с антигеном Се.

Следует также иметь в виду, что антигенные участки подсчитывают по количеству связавшихся с ними антител и это не всегда отражает истинное их число. Скрытые от доступа антител участки, расположенные в толще мембраны, а возможно, и на эндоцеллюлярной ее части, могут оставаться не учтенными.

На выраженность антигена D влияет ген С, ингибирующий в положении транс продукцию полипептидов D (см. Du). Ингибирующий эффект гена С на ген D проявляется и в положении цис. Так, по данным Rochna и Huges-Jones [568], эритроциты лиц CDe / cde содержат меньше антигенных участков D, чем эритроциты лиц cDE / cde, у которых ген С отсутствует.

Первое место по количеству серологически активных D-антигенных участков на поверхности клетки (до 200 тыс. на 1 клетку) занимают эритроциты гомозигот −D −/ −D − и *D*/*D* (табл. 4.10). Антиген D на этих клетках выражен столь сильно, что многие сыворотки анти-D с неполными антителами агглютинируют эти эритроциты в солевой среде подобно полным агглютининам. По силе реакции эти эритроциты напоминают клетки, обработанные протеолитическими ферментами. Последние удаляют с эритроцитов белки, препятствующие взаимодействию Rh-антигенов с неполными антителами. Эритроциты гетерозигот  −D −/СDе и *D*/СDе реагируют с неполными антителами слабее. Не все сыворотки, агглютинирующие эритроциты гомозигот, способны агглютинировать эритроциты гетерозигот. Эритроциты с другими генотипами, представленными на рис. 4.9, не агглютинируются неполными антителами в солевой среде.

У лиц (C)D(e), имеющих сниженную экспрессию (С) и (е), содержится меньше серологически активного D-антигена, чем у лиц −D − и *D*, однако существенно больше, чем у гомозигот сDE / cDE. Далее в соответствии с рис. 4.9 выраженность D-антигена на эритроцитах убывает в последовательности: cDE / CDe > cDe / cde > CDe / CDe > cDE / cde > CDe / cde > Cde / cDe. Последний ге-

нотип, Cde / cDe, в котором C и D находятся в позиции транс, нередко представляет собой Cde / cDue, продуцирующий слабый антиген Du. Эритроциты Du могут нести менее 500 D-антигенных участков, что находится на грани выявления даже такой чувствительной методикой, как непрямая проба Кумбса.

185