Материал: Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии

Предположение о том, что полипептиды Rh могут быть связаны в мембране эритроцитов с гликозилированным компонентом (гликопротеин Rh), было впервые высказано Gahmberg [295]. Далее было установлено, что гликопротеин Rh, преципитированный анти-D-антителами вместе с полипептидом Rh, имеет мол. массу 45–70 кДа, а полипептид Rh – 30 кДа.

Когда стало ясно, что полипептиды Rh связаны в клеточной мембране с гликопротеинами Rh, появились высказывания, что одни антигены Rh могут быть экспрессированы на полипептиде, а другие – на гликопротеине. Не исключали и третий вариант: некоторые антигены Rh представляют собой комплекс, состоящий из участков полипептида и гликопротеина. Присутствуя порознь, эти участки полипептида и гликопротеина не являются иммуногенными, а когда присутствуют одновременно, их комплекс приобретает иммуногенность.

Однако в последующих работах было установлено, что белковые последовательности, определяющие специфичность антигенов Rh, расположены на полипептидах, а не на гликопротеинах.

Структура полипептидов Rh

Антигенные детерминанты Rh расположены на негликозилированных нефосфорилированных полипептидах с мол. массой 30–32 кДа [129, 295, 483]. Полипептиды RhD и RhcE представляют собой цепь из 12 связанных со скелетом мембраны доменов [348], пересекающих мембрану эритроцита от эндодо экзоцеллюлярного уровня (рис. 4.5 и 4.6). Основная часть полипептида размещена в фосфолипидном бислое. На внешней стороне клетки домены соединены 6 выступающими над поверхностью мембраны петлями, на которых также могут располагаться серологически выявляемые Rh-антигены. N- и C-концевые участки полипептида погружены внутрь клетки [196]. Полипептид RhD, полученный искусственно в трансфектных клетках с помощью олигонуклеотидных праймеров и соответствующих кДНК людей Rh +, состоит из 417 аминокислот [147, 172, 590]. Из такого же числа аминокислот состоит полипептид RhcE, полученный таким же способом с использованием кДНК людей Rh − [138, 390, 418].

Рис. 4.5. Топология мембранных доменов Rh-Hr по Schenkel-Brunner [597].

176

Полипептид сЕ имеет 6 цистеиновых остатков, 5 из которых расположены в цитоплазматических петлях. Шестой цистеин (Цис-285) находится в 5-й внеклеточной петле [564]. Цистеин в позиции 311 полипептида RhcE замещен на тирозин в полипептиде RhD. Отдельные последовательности (мотивы), например Cys – His – Leu – Ile–Proвположении285–289,являютсяобщимидлявсехэпитопов:D,CcиEe.

Высокая степень гомологии между генами RHD и RHCE способствует генной конверсии, неравновесному кроссинговеру и образованию в результате этого гибридных генов, кодирующих продукцию новых антигенов Rh [597].

Rh-протеины высокогидрофобны и весьма прочно соединены с другими гидрофобными белками мембраны [336]. Обнаружена определенная связь Rh-полипептидов с гликофорином В, антигенами LW, гликопротеином, несу­ щим антигены Duffy, гликопротеином CD47 и так называемым Rh-ассоцииро­ ванным гликопротеином.

Rh-антигены устойчивы к воздействию протеолитических ферментов [295]. Антигены D и c (hr') разрушаются под воздействием N-этилмалеини­мида, хлормеркурибензоната и 2-нитробензойной кислоты. Это послужило для исследователей основанием полагать, что Rh-субстанция содержит тиоловые группы

[316, 319, 600, 646].

Рис. 4.6. Предполагаемая трехмерная структура доменов Rh-полипептида и Rhассоциированногогликопротеинавмембранеэритроцита(поAvent[141]).Светлыеитем- ныецилиндрыпредставляютдоменыRh-полипептидовDиСЕсN-иC-терминальными группами. На заднем плане условно представлен Rh-ассоциированный гликопротеин. Указаны участки разрывов при действии трипсина, папаина или бромелина, место расположения эпитопов D3, D4 и D9, экзо- и эндоцеллюлярные петли Rh-полипептида.

Как отмечали Dahr и соавт. [242], серологическая активность D-антигена утрачивалась под действием цистеиновых реагентов. После обработки эритроцитов дитионитробензойной кислотой (ДТНБК) антиген D инактивировался­ , однако активность его вновь восстанавливалась под действием дитиоэритритола. В то же время под действием глютатиона активность D-антигена­ не

177

восстанавливалась. Обработка эритроцитов хлормеркурифенилсульфониковой кислотой приводила практически к полной потере активности­ антигена D, которая не восстанавливалась дитиоэритритолом.

Йодацетамид не инактивировал D-антиген – это согласовывалось с предположением Dahr и соавт. о том, что цистеиновые остатки являются непосредственной составной частью D-антигена. Авторы пришли к выводу, что цистеиновая модификация Rh-протеина, в частности Cys 285 в 5-й внеклеточной петле, приводит к модификации антигена Rh.

Серологическая активность Rh-антигенов, как показал Green [317, 318], во многом зависела от содержания липидов в мембране эритроцитов. После вытяжки липидов из стромы n-бутанолом Rh-активность утрачивалась, а после инкубации стромы с липидным экстрактом она полностью восстанавливалась. Как указывает Schenkel-Brunner [597], липиды необходимы для оптимальной пространственной ориентации других структурных молекул в мембране эритроцита.

Обработка эритроцитов фосфолипазой, расщепляющей жирные кислоты, лектином, фосфатидилэтаноламином или фосфатидилсерином выраженно ингибировала активность антигенов c, D и e [320, 3366, 530].

На серологическую активность Rh-антигенов влияло обезвоживание мембраны эритроцитов [154, 181, 609]. Высокий уровень холестерола (соотношение холестерола и фосфолипидов 1,55) совпадал с повышенной вязкостью мембраны и большей выраженностью D-антигена. Низкий уровень холестерола (соотношение холестерола и фосфолипидов 0,55) сопровождался меньшей вязкостью мембраны и менее активным реагированием D-антигена [597].

Отсутствие Rh-полипептидов у людей с фенотипом Rhnull сопряжено с изменениями в структурной организации липидного слоя мембраны и нарушением водно-ионного транспорта в клетке.

Из ранних работ (до 1960 г.) известно, что резус-антиген термолабилен и слабеет при высушивании (П.Н. Косяков [69]). Сыворотки антирезус снижали свою активность при смешивании со стрептомицином, дериватами рибонуклеиновой кислоты, некоторыми сахарами и другими химическими веществами, из чего авторы делали предположения о возможной химической природе резус-антигена.

Наличие в эритроцитах Rh + Rh-ассоциированного гликопротеина, повидимому, вводило в заблуждение исследователей, полагавших, что антигены резус имеют полисахаридную природу.

Молекулярно-биологические исследования

Целью молекулярно-биологических исследований было ответить на вопрос: находятся ли антигенные детерминанты D, С / с и Е / е на разных белковых структурах или же они присутствуют на одном и том же полипептиде? Другой целью этих исследований было установить молекулярную структуру вариантов Rh-антигенов и кодирующих их генов.

178

Эксперименты с использованием трансфекции фрагментов ДНК [196, 496, 618] показали, что детерминанты С / с и Е / е расположены на одном полипептидном продукте, а D – на другом. Дополнительные доказательства того, что антигены Сс и Ее могут находиться на одном и том же полипептиде, полученыAvent и соавт. [145] в исследованиях с сыворотками анти-С, анти-с, анти-Е и анти-е, которые, как выяснилось, реагируют с разными участками одного и того же полипептида Rh.

Антигенные детерминанты Rh кодируются двумя похожими по структуре генами (Colin и соавт. [233], Arce и соавт. [138]). Один из них (RHD) определяет наличие трансмембранного белка, придающего эритроцитам D-актив­ ность. У лиц Rh + этот ген представлен одной или двумя копиями. Как уже упоминалось, у большинства лиц Rh − ген, кодирующий субстрат D, отсутствует. Находящийся в прилежащем локусе ген RHCE определяет экспрессию антигенов С, с, Е и е.

Гены RH в каждом гаплотипе с большой точностью контролируют количество вырабатываемого антигенного вещества. У разных членов одной и той же семьи гаплотип RH кодировал продукцию одинакового количества каждого присутствующего в фенотипе антигена (Rosenfield, Kochwa [393, 576]).

Принцип идентификации генов, ответственных за продукцию Rh-антиге­нов, сводится к следующему:

1)выделение несущего Rh-активность белка с помощью преципитации специфическими антителами;

2)расшифровка аминокислотной последовательности иммунодоминантного белка, приготовление комплементарных молекулярных зондов и конструкций для идентификации кодирующей ДНК (кДНК);

3)вживление (трансфекция) кДНК в клетки или плазмиды, не производящие аналогичного иммунодоминантного продукта;

4)идентификация геномного продукта трансфектных клеток или плазмид;

5)идентификация геномной ДНК (гДНК), представляющей собой собственно ген с кодовой записью иммунодоминантного продукта.

Клонирование Rh-полипептидов

В 1990-х годах 2 лаборатории независимо друг от друга получили совершенно одинаковые клоны кДНК полипептидов RhcЕ (Cherif-Zahar и соавт. [208], Avent и соавт. [148]).

Выделение кДНК, соответствующей полипептиду D, было осуществлено независимо 3 исследовательскими группами (Le Van Kim и соавт. [418],Arce и соавт. [138], Kajii и соавт. [390]). Последовательность аминокислот в белках, полученных при помощи кДНК RhD, отличалась от аминокислотной последовательности полипептида RhсЕ по 34–36 аминокислотным остаткам из 417 последовательностей (рис. 4.7).

179

Рис. 4.7. Аминокислотная последовательность транскриптов гена D и cE по

Mouro и соавт. [496] и Schenkel-Brunner [597]. Пунктир означает одинаковую аминокислотную последовательность сравниваемых полипептидов.

Полипептиды D и сЕ имеют высокую степень гомологии: клон полипептида D, выделенныйArce и соавт. [138], был на 96 % идентичен клону полипептида сЕ по последовательности нуклеотидов кДНК и на 92 % идентичен по структуре белка.

Le Van Kim и соавт. [418] показали, что полученные ими клоны кДНК являются продуктом гена D, поскольку фрагменты геномной ДНК, с которыми совпадали эти клоны, были получены от людей с фенотипом D +.

В то же время Kajii и соавт. [390] установили, что полученные ими клоны не были продуктом гена D, поскольку кДНК была идентифицирована у человека с фенотипом D −C +c + E +e + [390, 665, 666].

Данные о том, что у некоторых людей фенотип D − обусловлен делецией гена D, были получены Colin и соавт. [233] в экспериментах с использованием метода Саузерн-блот.

Клонирование Rh-гликопротеинов

Moore и Green [481] обнаружили, что в процессе иммунной преципитации полипептидов D и сЕ специфическими антителами одновременно с по­ липептидами преципитируются N-гликозилированные белки, получившие название RhAG (Rh-ассоциированные гликопротеины), или Rh-гликопротеины­ . Компоненты этих белков, сопровождающие полипептиды D и еС, имели несколько отличающуюся мол. массу, но одинаковую N-концевую­ аминокислотную последовательность [147].

180