гены с и е, c и eS, С и е не продуцируют антиген f и другие перечисленные выше антигены – ce S, rhi, CE, cE и Ce S соответственно.
В свете современных представлений о системе Rh-Hr как двухгенной уровень экспрессии антигенов, объясняемый ранее положением цис и транс соответствующих генов, получил новую интерпретацию. Антигены C, с, Е и е на полипептиде Rh кодируются аллелями Ce, cE, ce и CE не только в разных сочетаниях, но и в различном количестве, а также качестве того или иного антигена.
Имеются данные (Giles, Bevan [305], Heiken, Giles [342]) о существовании независимо наследуемых генов-супрессоров, Xor и XQ, не связанных с локусом Rh, которые, однако, влияют на экспрессию антигенов резус, в частности инициируют появление слабовыраженных форм CDe-комплекса: (C)D(e), (c)D(e) и других, а также фенотипа Rhnull.
Мутации с позиций иммуносеролога
Задолго до установления молекулярных различий в структуре полипептидов Rh и кодирующих их генов иммуносерологи классифицировали мутации, дающие начало новым групповым признакам, по поведению тех или иных антигенов и антител в серологических реакциях.
Доссе [50] разделил мутации на 3 категории.
Мутации с полной автономностью. Примером такой мутации служили антигены С и С W в системе антигенов СС Wс, гены которых до последних лет считались аллельными (см. СW и СX). Антиген C Wполностью автономен по отношению к антигену С. Это проявляется в том, что люди СС, Сс и сс могут вырабатывать антитела анти-С W. Некоторые сыворотки анти-С содержат комбинированные антитела анти-С + С W в несепарируемой форме и не могут быть разделены на анти-С и анти-С W адсорбцией эритроцитами С и С W. Вместе с тем чистые анти-С W-антитела (без примеси анти-С) встречаются относительно часто.
Вначале предполагали, что антиген С W наследуется независимо от С и с, проявляя полную автономность. Однако вскоре выяснилось, что он чаще присутствует в эритроцитах С +, чем в эритроцитах С −.
Аналогичными автономными свойствами обладает антиген С X по отношению к антигенам С, с и С W, а также антиген E W по отношению к антигенам Е и е.
Мутации без автономности. Этот тип мутации отражается на количестве синтезируемого антигенного субстрата, не затрагивая его специфических свойств. Например, эритроциты Du агглютинируются не всеми сыворотками анти-D, которые в 100 % случаев реагируют с обычными эритроцитами D +. Du не имеет собственной антигенной специфичности, отличающейся от D, однако передается по наследству кодоминантно, как D и все другие групповые антигены. Антитела анти-D могут быть полностью удалены из сыворотки адсорбцией эритроцитами Du, но сыворотка анти-D не можетбыть разделена на анти-D и анти-Du дифференциальной адсорбцией. В совокупности все эти признаки свидетельствуют о существовании генной мутации или
171
модификации гена D, которая не является автономной и проявляется лишь в виде слабовыраженного антигенного вещества.
Можнопривестиидругиепримерымутацийбезавтономности:СиСu,ЕиЕu. Промежуточные мутации. Например, антиген сv, описанный Race и соавт.
[549], имеет признаки двух антитетичных антигенов – С и с, представляя собой некую промежуточную форму этих антигенов. Эритроциты сv агглютинируются полными и неполными анти-с-антителами с такой же интенсивностью, как эритроциты гомозигот с / с, а также реагируют с некоторыми сыворотками анти-С. Между тем специфические анти-сv-антитела в чистом виде не встречаются.
Промежуточные формы антигенов наследуются кодоминантно.
Согласно современным представлениям о молекулярной структуре антигенов Rh (см. Строение системы Rh) приведенная классификация мутаций на основе иммуносерологических особенностей эритроцитов может показаться несколько наивной, однако именно такого рода сопоставления побудили молекулярных биологов искать объяснение групповым различиям на молекулярногенетическом уровне.
Связь локуса RH с хромосомой 1
О том, что гены RH находятся на хромосоме 1, свидетельствовал ряд фактов. К началу 1970-х годов накопились данные о частичной сцепленности генов RH с генами наследственного эллиптоцитоза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
(G-6-PD), пептидазы-С (PepC) и фосфоглюкомутазы (PGM1).
Результаты семейных исследований указывали на то, что перечисленные гены образуют взаимосвязанную группу близкорасположенных локусов и наследуются вместе независимо от пола. Из накопленных сведений можно было сделать только один вывод: гены RH не расположены на хромосомах X и Y. Вопрос, на какой хромосоме они располагаются, оставался открытым.
Сдвиг в этой области достигнут благодаря гибридизации ядерных клеток мыши и человека (Ruddle и соавт. [587]). При культивировании гибридных клеток, имеющих 2 набора хромосом (человека и мыши), человеческие хромосомы постепенно вытеснялись мышиными. Эта модель оказалась удобной для изучения продукции ферментов, в частности пептидазы С. Установлено, что утрата хромосомы 1 сопровождалась потерей способности культивируемых клеток продуцировать пептидазу-С, а поскольку гены PepC, G-6-PD, PGM1 и RH связаны, было сделано заключение,чтовсягруппагенов,втомчислегенRH,находитсянахромосоме1.
Дополнительные данные в поддержку этого заключения были получены Marsh и соавт. [462]. Авторы наблюдали больного миелофиброзом, у которого была кровяная химера: 7 % эритроцитов, циркулирующих в его кровотоке, были резус-положительными (CcDee), а остальные 93 % – резус-отрицательными (cde). Один из родителей больного имел фенотип CCDee, т. е. не содержал гаплотипа cde, который мог передать по наследству. Сам пациент передал гаплотип CDe своему сыну. Авторы предположили, что эритроциты CcDee пациента
172
происходили из ростка, в котором гаплотипы CDe и cde были функциональными, а эритроциты cde происходили из ростка, в котором гаплотип CDe являлся молчащим (cde/ − − −). При хромосомном анализе выявлена делеция короткого плеча хромосомы 1 в 95 % ядерных клеток крови пациента, на основании чего авторы заключили, что потеря небольшого участка короткого плеча хромосомы 1, очевидно, привела к потере функционального гаплотипа CDe. Поскольку пациент был гетерозиготен по локусу PGM1 и содержал оба типа этого фермента, авторы сделали вывод, что локус RH не только расположен на хромосоме 1, но и отстоит от центромеры хромосомы дальше, чем локус PGM1.
В 1975 г.Turner и соавт. (цит. по Issitt иAnstee [374]) обследовали семью аме-
риканских индейцев, в которой одни из членов были гомозиготны по гаплотипу −D −, другие – гетерозиготны, а третьи не имели этого гаплотипа. У гомозигот была обнаружена делеция короткого плеча обеих хромосом 1, у гетерозигот – делеция короткого плеча одной хромосомы, а у родственников, не имевших гаплотипа −D −, делеции не было.
Хромосомный анализ лиц Rhnull и −D − не выявил корреляций, подобных описанным выше. Хромосомные аберрации (делеции и транслокации) не во всех случаях можно выявить существующими цитологическими методами исследования. Обнаружение корреляции серологических и кариологических признаков большая редкость. В литературе имеются сообщения о пациентах с кровяными химерами, содержащими 2 популяции эритроцитов, различающиеся по антигенам Rh. Однако эритроцитарные химеры, так же как и снижение экспрессии антигенов в период обострения болезни, наблюдают редко, и их трудно связать с изменениями в хромосоме 1, которые чаще всего отсутствуют.
Лишь с появлением методов молекулярной биологии, гибридизации in situ кДНК было достоверно установлено Cherif-Zahar и соавт. [211] место расположения локуса RH на коротком плече хромосомы 1, а именно в районе 1р34.3– 1р.36.13. Локусы групп крови Fy (Duffy), Sc (Scianna), Cr (DAF, Cromer), Kn (CR1, Knops) и Rd (Radin) также расположены на хромосоме 1.
Строение системы Rh
Химия антигенов Rh
Долгое время химическая структура антигенов Rh оставалась загадкой. Многочисленные попытки выделить этот антиген в чистом виде и проверить его серологические свойства резус-антителами были безуспешными. Высказывалось суждение о том, что этот антиген в серологически активном виде не может существовать вне клеточной мембраны и, будучи выделенным из нее, тотчас инактивируется. Такое мнение поддерживалось сведениями о том, что нагревание и высушивание эритроцитов снижают серологическую активность антигенов Rh.
Разработка адекватных методов исследования гидрофобных структур мембраны эритроцитов дала существенный сдвиг в этой области. Появились
173
сообщения Green [316] о том, что экспрессия антигенов D и С на эритроцитах связана с тиоловыми группами, и, следовательно, эти антигены по своей природе относятся к белкам, а не к полисахаридам, как считали раньше по аналогии с полисахаридами А и В.
Использование глутатионмалеимидмембранных зондов также указывало на причастность экзофациальных тиоловых групп к D-специфичности. Однако значение свободных тиоловых групп в формировании антигенов Rh было поставлено под сомнение Suyama и соавт. [646].
Далее было показано (Green [315]), что липидные фракции, экстрагиро ванные из стромы эритроцитов n-бутанолом, а также получаемый при этом нерастворимый белковый осадок не обладают серологической активностью по отдельности, но при объединении этих фракций специфическая D-активность субстрата вновь проявляется. Таким образом, стала проясняться белковолипидная природа субстанции Rh.
Hughes-Jones и соавт. [366] подтвердили, что основными компонентами, необходимыми для экспрессии антигена D, являются фосфолипиды, поскольку обработка мембран эритроцитов фосфолипазами А2 и С инактивировала антигены D, Сс и Ее. Интересная деталь: как было установлено Hughes-Jones и соавт. [366], Green и соавт. [320], анти-D-антитела, адсорбированные на эритроцитах D +, предотвращали инактивацию антигена D фосфолипазой А2, что указывало на специфичность воздействия этого фермента именно на структуруноситель антигена D.
Попытки выделить и идентифицировать белок Rh, предпринятые до 1980-х годов, позволили составить общую физико-химическую характеристику антигенов Rh. Предварительно установлено, что белок D имеет мол. массу 7–10 кДа. Другие исследователи сообщили, что антигены Rh расположены на анионном транспортном белке в полосе 3 [678]. Полоса 3, как теперь известно, соответствует антигенам Diego. Впоследствии полученные результаты были объяснены излишним протеолизом полипептидов D при очистке, а также тем фактом, что оба белка одинаково гидрофобны и мигрируют вместе в процессе выделения из мембраны эритроцитов.
Прорыв в исследовании антигенов Rh произошел в начале 1980-х годов, когда появились методы выделения растворимых комплексов «D-анти-D» иммунопреципитацией антигенов специфическими антителами, меченными радиоактивным йодом (Moore и соавт. [483], Ridgwell и соавт. [564]). Вскоре были идентифицированы полипептиды с мол. массой 32–34 кДа, несущие серологическую активность D, Cс и Eе, и отсутствовашие на эритроцитах Rhnull. Каждый полипептид содержал экзофациальные тиоловые группы [564].
Далее выяснилось, что антигены е и Е расположены на одном полипеп тиде, а антиген D – на другом.
Картирование Rh-полипептидов, проведенное Bloy и соавт. [172], Blanchard и соавт. [168], показало, что фракции, иммунопреципитированные
174
сыворотками анти-с и анти-Е, практически идентичны, а фракции, иммунопреципитированные сыворотками анти-D, существенно от них отличаются.
Hughes-Jones и соавт. [363] не наблюдали конкурентного подавления связывания анти-с-антител антителами анти-Е и анти-D, а также ингибиции связывания анти-Е-антител антителами анти-с и анти-D, что свидетельствовало о размещении антигенов D, с и Е на разных участках полипептидов. При картировании установлено, что полипептид D имеет отличительные участки, не характерные для полипептидовсиЕ,иэтополностьюсовпалосрезультатамииммунопреципитации.
Gahmberg [295] отметил, что полипептид D не содержит углеводов в отличие от других белков, расположенных на внеклеточной поверхности мембраны эритроцитов. Такое заключение было основано на невозможности пометить полипептид D галактозоксидазой и перийодатом, неспособностью очищенного полипептида связываться в лектиновых колонках, а также неэффективностью обработки эндо-N-ацетилглютаминазой Н и эндо-β-галактозидазой .
Гликозилирование как обычная составляющая синтеза мембранных элементов не характерно для белка Rh. Он собирается в виде комплекса, включающего готовые полипептиды Rh и гликопротеины Rh, причем полипептиды Rh являются продуктом одного гена, расположенного на хромосоме 1, а гликопротеины Rh – продуктом другого гена, расположенного на хромосоме 6. Точно так же собираются антигены системы Kell: белок Kx ковалентно связывается с гликозилированным гликопротеином Kell, но оба субстрата являются продуктами разных генов, один из которых расположен на аутосоме, другой (Kx – на хромосоме Х.)
После того как полипептиды Rh были идентифицированы, несколько групп исследователей попытались изучить их аминокислотную последовательность, а также создать олигонуклеотидные зонды и выделить ДНК, кодирующую Rh. Наиболее эффективными оказались методы препаративной иммунопреципитации (Avent и соавт. [147], Bloy и соавт. [172] с использованием мышиных и человеческих моноклональных антител. Другие исследователи (Saboori и соавт. [590]) использовали для очистки белков неиммунологические методы, в частности хроматографию в гидроксиапатите кальция (Saboori и соавт. [589]). Очищенные полипептиды метили радиоактивным йодом и расщепляли химотрипсином.
Исследования показали, что полипептид Rh, преципитированный анти-D- антителами, имел ту же N-концевую последовательность (до остатка 13), что и полипептид Rh, преципитированный мышиными моноклональными антителами серии R6A [147]. Однако, поскольку антитела R6A реагировали с эритроцитами D −−, следовал вывод, что антиген D находится на другом полипептиде, реагирующем с анти-D-антителами, и что анти-D-антитела человека и моноклональные антитела R6A мыши определяют 2 разных, но тесно связанных полипептида. Исследование аминокислотной последовательности белков, выделенных хроматографией в гидроксиапатите из клеток D + и D −, подтвердило их сходство [172, 590].
175