В этом подразделе обосновываются необходимость биохимической индикации состояния рыб и определяются основные принципы эколого-биохимического мониторинга.
Жизнь в водоеме, в отличие от наземных условий, характеризуется большей зависимостью гидробионтов от факторов среды. Водные экосистемы, сообщества, организмы особо чувствительны к нарушению химического состава среды. Многие фундаментальные концепции современной биологии были установлены в процессе изучения водных организмов.
С общебиологических позиций рыбы, как одна из важнейших групп современных животных, представляют исключительный интерес, поскольку они характеризуются своеобразными особенностями физиологии и биохимии питания и дыхания. Кроме того, рыбы являются наиболее удобными объектами в исследованиях, позволяющих установить степень влияния на живой организм различных факторов, в том числе токсикантов. Так же рыбы интегрируют неблагоприятные эффекты комплекса различных воздействий, имеют достаточно большие размеры и продолжительность жизни, обладают резистентностью к сублетальным воздействиям различных веществ и могут быть использованы для прогноза различного рода воздействий на водные экосистемы и здоровье человека, употребляющего эту рыбу в пищу.
Анализ материалов, накопленных за длительное время исследований в лаборатории экологической биохимии за последние годы, привел к необходимости создания единого комплексного подхода или индикационной системы биохимических показателей.[13] В этом подходе должны были учитываться современная экологическая и биохимическая парадигмы и содержаться разнообразные внутренние контроли, повышающие достоверность получаемых данных при малой выборке, когда вынужденно использовались усредненные проблемы.
Исходя из этих условий, и была разработана принципиальная концепция такой комплексной биохимической системы, которая могла бы с успехом быть использована для выявления различных отклонений физиологического состояния рыб, возникающих под влиянием разнообразных экологических факторов, в том числе имеющих и антропогенный характер.
Н.Н. Наумовой и Р.У. Высоцкой [13] была разработана комплексная система тестов, включающая в себя несколько принципиальных позиций, в которых учитывается экологическая и таксономическая вариабельность объектов, стадии их онтогенеза, необходимость использования в анализах разных органов тканей, уровень достижений биохимической диагностики в медицине, применение различных контролей, уменьшающих ошибку современных микрометодов при небольшой статистической выборке, а также разработку и использование методов полевой биохимии.
Рассмотрим эти принципы:
Принцип исследования комплекса органов рыб и других гидробионтов. Изменение биохимического статуса разных органов при воздействии на организм различных факторов среды неоднозначно. Поэтому при проведении эколого-биохимического мониторинга необходимо на первых порах использовать максимально возможное число органов рыб для того, чтобы отобрать наиболее показательное и реагирующее на действующие факторы среды. Наибольший интерес, обычно представляет печень, как орган, где происходит детоксикация ксенобиотиков, особенно важны в этом плане ферменты, участвующие в процессах детоксикации чужеродных веществ и некоторых собственных метаболитов.
Онтогенетический принцип. Повреждающее действие факторов среды (имеются в виду прежде всего токсические вещества антропогенного происхождения) в значительной степени зависит от этапа развития организма, поэтому при эколого-биохимическом мониторинге необходимо это учитывать.
Принцип комплексности тестов заключается в том, что для избежание ошибок при интерпретации данных, что особенно важно при диагностике и оценке хронических и слабых токсикогенных воздействий на гидробионтов, нужны не отдельные, пусть даже достаточно чуствительные биохимические тесты, а система тестов, в которой изменение каждого показателя было бы логически, исходя из современных представлений о схеме метаболических путей, связано с теоретически ожидаемым изменением других показателей. Этот подход не только служил бы внутренним контролем получаемых данных, но и позволил бы вскрыть механизм и направление биохимических изменений.
Принцип биохимической диагностики обеспечивает идентификацию действующих факторов. Система биохимических тестов, применяемых в эколого-биохимическом мониторинге, как и в медицине, должна ответить на вопрос, какого рода фактор действует на водные организмы.
Принцип адекватности методов задачам эколого-биохимического мониторинга.
Эколого-биохимический мониторинг используется для контроля биохимического состояния гидробионтов в естественной для них среде - в водоеме. Поэтому методы, применяемые для этих целей, должны соответствовать решению двух задач: оперативного получения результатов биохимических анализов в полевых условиях, что может определить последующие методы мониторинга, и фиксации материала в полевых условиях, и доставки его в лабораторию для последующего анализа.
3. РОЛЬ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ЭКОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ АДАПТАЦИЯХ РЫБ К ИЗМЕНЯЮЩИМСЯ ФАКТОРАМ СРЕДЫ
.1 Участие лизосомальных ферментов в адаптациях рыб к температуре среды
Материалы, представленные в этом подразделе, демонстрируют возможность использования изменяющихся биохимических показателей в качестве тестов при индикации состояния рыб и других гидробионтов, а также при оценке экологической ситуации в водоеме. Подробно излагаются сведения по адаптациям на уровне ферментов, поскольку именно в этой области имеется наибольший опыт исследований.
Любая сторона жизнедеятельности живого организма испытывает влияние множества абиотических и биотических факторов, таких как освещенность и долгота дня, температура, минеральный и газовый состав среды, характер грунтов и течений, качественный состав и количество пищевых объектов, взаимоотношения с особями своего вида и другими организмами и т.д.
Например, при колебаниях температуры в среде обитания изменяется скорость отдельных ферментативных реакций, а в результате этого и общая интенсивность обмена веществ у изучаемых животных. Как правило, при повышении температуры биохимические реакции ускоряются, а при понижении замедляются. Интенсивность этих изменений не одинакова, акклиматизация к тем или иным температурам связана с дифференциальными эффектами в различных ферментативных системах. Любое температурное воздействие отражается на состоянии лизосомального аппарата животных.
Рассмотрим влияние температуры в аквариальных экспериментах. Для выявления особенностей в механизмах температурных адаптаций было проведено сравнительное изучение ферментных систем лизосом к разных по экологии рыб - теплолюбивого карпа и холоднолюбивой радужной форели. Как известно, эти виды обладают неодинаковыми способностями адаптироваться к различным диапазонам температур.
Результаты опыта показывают, что при тепловой акклиматизации у радужной форели в печени происходит некоторое снижение активности лизосомальных фосфатазы, РНКазы и бетта-глюкозидазы, а в других органах (мышцах, почках, селезенке) повышение внешней температуры вызвало рост активности лизосомальных гидролаз.
Сопоставление полученных в результате эксперимента данных позволяет сделать заключение о существовании одинаковой направленности в изменении общей активности лизосомальных ферментов в одноименных органах у разных видов животных при температурной адаптации.
Температура окружающей среды в значительной степени определяет интенсивность метаболических процессов в организме рыб как пойкилотермных животных, для которых ведущим параметром в поддержании гомеостаза является сохранение жизнедеятельности в условиях низких температур. Известно, что в течении года температура водоема значительно изменяется. Эти колебания быстро передаются биохимическому аппарату клеток рыб и сказываются, прежде всего, на скорости и интенсивности реакций метаболизма.
Особенно велико значение температурного режима для рыб на ранних этапах развития. Так, развитие лососевых рыб в эмбриональный период определяется в первую очередь температурным фактором, чем южнее место обитания лосося, тем раньше наблюдается выход личинок из бугров.
В дальнейшее темпы роста молоди атлантического лосося, их способность переходить в миграционное состояние прямо зависят от длительности периода с оптимальными температурами.
В зависимости от климатических условий региона речной период молоди лосося может варьироваться от одного до семи лет. Количество дней с оптимальной для роста и развития рыбы температурой за весь речной период должно составить в сумме девять месяцев. При понижении или повышении температуры рост и развитие лосося значительно замедляется.
Н.Н. Наумовой и Р.У. Высоцкой [13] предоставлены результаты экспериментов, проведенне на Кемском рыбоводном заводе по изучению влияния температуры воды в период выдерживания и подращивания личинок на некоторые биохимические показатели, в том числе и на активность и кислость фосфатазы.
Полученные в результате эксперимента данные отражают своеобразие реакции лизосомального аппарата развивающегося организма на воздействие экстремальных температурных условий. Эта реакция зависела от вида рыбы, этапа ее развития и специфики действия изучаемой ферментной системы.
Рассмотрим влияние и сезонную динамику лизосомальных ферментных систем. Вопрос о температурных адаптациях рыб теснейшим образом связан с сезонными колебаниями метаболизма, для пойкилотермных животных. Именно температура является ведущим фактором, определяющим ритмичность биологических процессов.
В течении года температура в водоемах значительно изменяется. Н.Н. Наумовой и Р.У. Высоцкой было произведено изучение динамики активности лизосомальных ферментов у пяти видов рыб (форели, сига, окуня, щуки, налима), находившихся в естественных условиях. Исследование показало, что в зимне-весенние месяцы общая активность лизосомальных ферментов в печени рыб была в 2 - 4 раза больше, чем в летние.
Ими же затрагивается вопрос о влиянии температуры на активность ферментов в ходе зимовки рыб. Это особенно необходимо учитывая, что в жизненный цикл некоторых видов рыб, например, карповых, включен этап, который называется «зимовка».
Гибель молоди карпа в зимовальный период, как показывают исследования, в значительной степени является результатом физиолого-биохимической неподготовленности ее к зимовке, хотя непосредственная причина ее гибели - неподходящие условия зимовки.
Н.Н. Наумовой и Р.У. Высоцкой была проведена экспериментальная работа на базе ВНИИ прудового рыбного хозяйства, для того, чтобы выявить биохимическое своеобразие реакции организма молоди карпа на отдельные экстремальные факторы во время зимовки.
Полученные данные позволили сделать вывод об активном участии лизосом в биохимической адаптации организма рыбы к меняющейся температуре среды, о включении их на определенном этапе адаптивных перестроек в механизмы регуляции ферментативных реакций. Выяснилось, что у холодноводной радужной форели и обитающего в теплых водах карпа механизмы адаптации к температуре одинаковы. Существует тканевая специфичность адаптивных перестроек ферментов в реакции. Адаптивные преобразования в клетке осуществляются, как за счет количественных изменений содержания ферментов, так и за счет регуляции качественного состава их изоформ.
.2 Влияние гипоксии на активность лизосомальных ферментов
Важным экологическим фактором, с которым связано удовлетворение энергетических потребностей организма рыбы является наличие кислорода в воде. Концентрация кислорода во внешней среде оказывает влияние на темпы роста и развития рыб. При гипоксии организм переключается на альтернативные источники обеспечения энергией. Так, при гипоксии и полной аноксии для энергообеспечения разные экологические группы рыб используют в той или иной степени катаболизм белка.
Н.Н. Наумовой и Р.У. Высоцкой показана и проанализирована работа по изучению влияния этого фактора на активность лизосомальных и некоторых других ферментов у рыб.
В проведенных экспериментах установлено, что длительная гипоксия (6 недель) вызывала снижение уровня активности лизосомальных протеиназ, что объяснялось снижением адаптационных возможностей лизосомального аппарата. В этих опытах отмечалась значительная гибель икры сига.
В результате полученных данных можно увидеть, что у молоди карпа происходило возрастание активности кислой фосфатазы и катепсина D в ответ на кратковременную гипоксию и снижение активности лизосомальных ферментов в печени и мышцах рыб, живших в условиях с повышенным содержанием кислорода.
.3 Роль лизосомальных ферментов в реакциях рыб на токсические воздействия
Как известно, количество токсических веществ, поступающих в водоемы с промышленными, хозяйственными и бытовыми стоками, исчисляется десятками тысяч и с каждым годом этот список пополняется множеством новых, синтезированных человеком химических соединений, которые могут составить опасность для животных, в том числе гидробионов.
Современные исследования по водной токсикологии проводятся на молекулярном, субклеточном, тканевом и организменном уровнях, поэтому ихтиотоксикология опирается на достижения биохимии, физиологии и экологии рыб.
Рыбохозяйственная токсикология призвана решать вопросы, связанные с влиянием токсикантов на динамику численности и запасы экономически ценных видов рыб. В результате многочисленных исследований установлены прямой и косвенный пути влияния токсикантов на рыбопродуктивность водоемов, то есть непосредственное токсическое влияние на все стадии жизненного цикла рыб, начиная с оплодотворенной икринки и кончая взрослым организмом, а так же на кормовую базу рыб и условия их обитания, на физико-химический и гидробиологический режим водоемов.
Загрязнение вод отрицательно сказывается на всех звеньях трофической цепи, но особое значение имеет исследование действия токсикантов на рыб, являющихся последним звеном пищевой цепи, в котором токсические вещества концентрируются.
Чрезвычайно важной и трудной задачей ихтиотоксикологии является диагностика отравлений рыб в естественных водоемах. Задача эта усложняется тем, что, часто в водоемы попадает комплекс загрязнений от нескольких источников. В этом случае необходимы эксперименты для выяснения картины отравлений рыб той или иной группой веществ, определения приоритетных токсикантов. Причем, следует выявлять всю гамму изменений, начиная с поведения и кончая внутренними показателями отклонения от нормы: биохимическими, физиологическими, морфологическими и др.
Особое внимание уделяется исследованию влияния сточных вод целлюлозно-бумажного комбината (ЦБК) на лизосомальный аппарат рыб. Сточные воды предприятий целлюлозно-бумажной промышленности остро токсичны для гидробионтов. В их составе содержатся такие токсические вещества, как фенолы, меркаптаны, лигнин, сернистые соединения и многие другие, поэтому их выпуск в водоемы вызывает нежелательные последствия, оказывает негативное влияние на гидробионтов.
Для выяснения влияния и степени токсичности некоторых компонентов промышленных стоков на организм рыбы Н.Н. Наумовой и Р.У. Высоцкой был проведен эксперимент на Выгозере, на берегу которого расположен крупнейший в Европе Сегежский целлюлозно-бумажный комбинат. Лещей отловленных в чистой зоне, помещали в садки, которые устанавливали в загрязненной промстоками зоне озера. Через определенные интервалы времени рыбу брали для проведения биохимического анализа.
Результаты проведенного эксперимента показали, что реакция организма рыбы на этот фактор очень сложна и зависит от времени нахождения в условиях эксперимента. Сотрудниками лаборатории было отмечено, что липидный состав лизосомальной фракции, выделенной из печени этих лещей, под влиянием сточных вод сильно изменяется. Полученные результаты исследования позволили авторам сделать вывод о том, что сложная смесь химических агентов, которой является сульфатный щелок, при воздействии на лизосомы приводит к разрушению лизосомальных мембран и выходу кислых гидролаз в цитоплазму клетки.