Дипломная работа: Антипролиферативное действие карнозина и его производных на опухолевые клетки нейрального происхождения

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Культуры клеток

В работе были использованы следующие клеточные линии: феохромоцитома крысы (РС-12); карцинома горла и рта (FaDu, Cal27) и молочной железы (MB231) человека; глиобластома человека (U-118-MG). Клетки PC-12 культивировали в среде RPMI 1640 с 25 мМ HEPES и 24 мМ бикарбоната натрия (ПанЭко, Россия), с добавлением 2 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), 20 мкг/мл гентамицина (ПанЭко, Россия) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко, Россия). Клетки FaDu и Cal27 культивировали в среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) и 100 ед/мл ПенСтреп (Gibco, США). Клетки MB231 инкубировали в среде RPMI 1640 (Gibco, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) и 100 ед/мл ПенСтреп (Gibco, США). Клетки U-118-MG культивировали в смеси DMEM:F12 (1:1) (Gibco, США) с добавлением 15 мМ HEPES (Gibco, США), 1 мМ пирувата натрия (Gibco, США), 10 мкг/мл инсулина (Sigma Aldrich, США), 5 нг/мл фактора роста фибробластов (Sigma Aldrich, США), 15% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) и 100 ед/мл ПенСтреп (Gibco, США). Клетки содержали в СО₂-инкубаторе (ShelLab, США) в присутствии 5% СО2, 98% влажности и 37?С.

2.2 Исследуемые соединения

Карнозин (чистота 99%) был любезно предоставлен “Hamari Chem., Ltd”, Осака, Япония. Гомокарнозин (чистота 99%) и анзерин (чистота 99%) были приобретены, соответственно, в “Hamari Chem., Ltd” и “Yaizu Suisankagaku Industry Co.,Ltd.” (чистота 99%). N-ацетилкарнозин был синтезирован рутинным путем в Лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии ФГБУ “НЦН” РАМН (чистота 98,7%, определена с помощью HPLC). L-гистидин-в-аланин был синтезирован рутинным путем в Исследовательском Институте Химического Разнообразия (чистота 98%, определена с помощью HPLC). Пинеалон был предоставлен Научно-производственным центром ревитализации и здоровья.

2.3 Исследование клеточной пролиферации

2.3.1 Время удвоения популяции

Время удвоения популяции (Тd) - это период времени, за который происходит увеличение количества клеток в два раза. Для вычисления Тd клетки высаживали в чашки Петри в небольших разведениях. Каждые два дня клетки снимали с помощью трипсина (Gibco, США), считали их количество с помощью Z1 Coulter Counter (Beckman Coulter, США) и строили кривые роста (Рис. 2.1). Время удвоения популяции (Тd) рассчитывали на экспоненциальном участке роста по формуле:

Тd=0.693t/ln(N_t/N₀),

где t - время (дни), N₀ - начальное количество клеток, N_t - количество клеток ко дню t. N_t вычисляли по уравнению экспоненциальной линии тренда (Рис. 2.1).

Рисунок 2.1. Пример кривой роста с экспоненциальной линией тренда и уравнением линии тренда для вычисления времени удвоения популяции. x - время (д), y - количество клеток ко дню х.

2.3.2 Эффективность посева и выживаемость клеток

Выживаемость клеток определяли по их способности формировать колонии. Клетки рассеивали в низких разведениях в 60 мм чашки Петри, по истечении 10 дней клетки фиксировали 2-4 мин в 70% этаноле, разведенном на фосфатном буфере, окрашивали 10 мин с помощью раствора содержащего 0.05% бриллиантового синего G-250, 50% метанола, 5% уксусной кислоты, 45% воды. Далее подсчитывали количество колоний состоящих из 50 и более клеток и вычисляли процент клеток образовавших колонии, эффективность посева (ЭП), по формуле:

ЭП = (количество колоний/количество посаженных клеток) х 100.

Выживаемость рассчитывали как процентное соотношение ЭП в клетках, обработанных карнозином или подвергнутых действию ионизирующего излучения, к ЭП клеток в контроле.

2.4 Проточная цитометрия

В данной работе все измерения проводили на проточном цитометре FACSCalibur (BD, США), оснащенном ионным аргоновым лазером с длинной волны 488 нм и двумя светофильтрами: 585/42 нм для красной флуоресценции (PI) и 530/30 нм для зеленой флуоресценции (ФИТЦ, DCF).

2.4.1 Измерение уровня АФК

Уровень внутриклеточных АФК измеряли с помощью флуоресцентного красителя 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетата (DCFН₂-DA) (Рис. 2.2).

Рисунок 2.2. Реакция превращения DCFH₂-DA в DCF (из [250] с изменениями). См. пояснения в тексте.

DCFН₂-DA представляет собой липофильное соединение, легко проникающее через мембрану живых клеток. Внутриклеточные эстеразы отщепляют ацетильные группы от DCFН₂-DA, превращая его в 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин (DCFН₂), для которого мембрана живой клетки уже непроницаема. Под действием внутриклеточных АФК (в основном Н₂О₂) происходит окисление DCFН₂ с образованием флуоресцирующего продукта 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCF, л_ex=504 нм, л_em=529) [250]. Для измерения уровня АФК клетки инкубировали с 100 мкМ DCFН₂-DA (Biotium, США) в течение 30 мин в темноте (37^оС) и затем анализировали на проточном цитометре. Данные обрабатывали в программе CellQuest Pro (BD, США) и рассчитывали среднее значение интенсивности флуоресценции.

2.4.2 Определение доли мертвых клеток

Долю мертвых клеток определяли по интенсивности свечения флуоресцентного красителя йодида пропидия (PI) (Рис. 2.3.А). PI количественно связывается нуклеиновыми кислотами путем интеркаляции между основаниями двойной цепи ДНК или РНК в соотношении: 1 молекула красителя на 4-5 пар оснований [251, 252]. После связывания с нуклеиновой кислотой флуоресценция PI усиливается в 20 - 30 раз и максимум испускания смещается на 15 нм в УФ-сторону (максимум поглощения (л_ex) 535 нм, максимум испускания (л_em) - 617 нм) [253].

Рисунок 2.3. Флуоресцентные красители использованные в работе. (А) Йодид пропидия (PI). (Б) 5-бромдезоксиуридин (БДУ).

Для определения доли мертвых клеток клетки инкубировали с 1 мкМ PI (Invitrogen, Germany) в течение 3 мин в темноте при комнатной температуре (t_комн) и затем анализировали на проточном цитометре. Данные обрабатывали в программе Cell Quest Pro (BD, США) и рассчитывали среднее значение интенсивности флуоресценции в Microsoft Exel (Microsoft, США).

2.4.3 Анализ клеточного цикла

Распределение клеток по фазам клеточного цикла измеряли по интенсивности свечения PI (Рис. 2.3.А). PI связывается с ДНК пропорционально его количеству, то есть, чем выше содержание ДНК, тем интенсивнее флуоресценция PI. Количество ДНК в разных фазах клеточного цикла неодинаково. G₀ и G₁ фазы характеризуются диплоидным набором хромосом - 2n, где n - это количество хромосом, а 2 обозначает, что каждая хромосома содержит только две хроматиды. Во время S фазы происходит удвоение хроматид в каждой хромосоме, которое завершается к началу G₂ фазы, поэтому набор хромосом клеток в G₂ фазе составляет 4n. Клетки, содержащие >2n, но <4n хромосом, относятся к S фазе (Рис. 2.4). Иногда G₁ пику предшествует sub-G₁ пик, который отражает количество апоптотических клеток. Фрагментация ДНК под действием эндонуклеаз при апоптозе приводит к образованию большого количества коротких ДНК фрагментов. Часть ДНК фрагментов теряется при подготовке проб, приводя к снижению внутриклеточного количества ДНК, которое в апоптотических клетках составляет <2n, что отражается в появлении sub-G1 пика.

Рисунок 2.4. Пример анализа клеточного цикла согласно содержанию ДНК. См. пояснения в тексте.

Для анализа клеточного цикла клетки фиксировали в 70% этаноле в течение 12 ч при - 4^оС. Фиксированные клетки отмывали от этанола и инкубировали 30 мин с 1 мг/мл РНКазы (Invitrogen, Германия), затем 60 мин с 35 мкг/мл PI (Invitrogen, Германия) в темноте при t_комн. Данные обрабатывали с помощью программы ModFit LT^TM (BD, США).

2.4.4 Двухпараметрический анализ клеточного цикла

Для двухпараметрического анализа клеточного цикла был использован маркер клеток в S фазе - 5-бромдезоксиуридин (БДУ) (Рис. 2.3.Б) [170, 254]. БДУ представляет собой аналог нуклеотида тимидина и включается в ДНК во время репликации, то есть в S фазе. Клетки инкубировали 30 мин с 5-бромдезоксиуридином (БДУ) (37^оС) и фиксировали в 70% этаноле в течение 12 ч при - 4^оС. Фиксированные клетки инкубировали 30 мин в 0.4 мг/мл пепсина, приготовленном на 2 N HCl, и нейтрализовали в 0.1 M боратном буфере. Пробы центрифугировали (1500 об/мин, 5 мин при 4^оС), осадок инкубировали 1 ч с мышиными антителами к БДУ (1:10, BD, США) и 1 ч с антимышиными козьими флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ)-коньюгированными антителами (1:10, BD, США). Далее клетки инкубировали с РНКазой и PI (см. предыдущий пункт). Данные обрабатывали в программе FlowJo v8.8.7.

2.5 Иммуноблоттинг

Для выделения белков клетки разрушали с помощью ультразвука в лизирующем буфере, содержащем фосфатный буфер (pH 7.8,) ингибитор фосфатаз (PhosSTOP, Roche, США), коктейль ингибиторов протеаз (Sigma, США), 2% NP-40 и ДНКазу (0,01 ед/мкл, Zimo Research Corp., США). Лизаты центрифугировали, для Иммуноблоттинга использовали супернатант.

Белки разделяли в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по Леммли [255] и переносили с помощью полусухого электротранспорта на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad, США). Места неспецифического связывания 1 ч блокировали в 5% молоке. Мембраны инкубировали с антителами против MnСОД (1:1000, Millipore, США), циклина B1 (1:1000, BD, США), НАДФН (1:500, BD, США) и актина (1:1000, Millipore, США). В качестве вторичных антител были использованы: меченные пероксидазой хрена антимышиные овечьи антитела (1:5000, GE Healthcare, США) и антикроличьи ослиные антитела (1:10,000, GE Healthcare, США). Иммунореактивные полоски визуализировали с помощью набора Pierce ECL 2 Western Blotting Substrate (Thermo Scientific, США) согласно инструкции разработчика и детектировали хемилюминисценцию с помощью Typhoon FLA 7000 (General Electric, США). Насыщенность полос анализировали в программе ImageJ (NIH, США). Уровень актина и НАДФН использовали для коррекции загрузки белка.

2.6 Определение активности MnСОД

Белки выделяли по методу, описанному в предыдущем разделе (2.5), и разделяли с помощью электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле без додецилсульфата по методу предложенному Weydert et al. [66, 256]. Гель инкубировали 20 мин при t_комн в окрашивающей смеси, содержащей 2,43 мМ нитросиний тетразолий, 2,8Ч10^?5 M рибофлавин и 28 мМ ТЕМЕД, и проявляли на свету до появления прозрачных полос. Метод основан на том, что на свету рибофлавин образует супероксид, который превращает нитросиний тетразолий из желтого в темно синий, что окрашивает гель. Поскольку MnСОД катализирует реакцию дисмутации супероксида, то MnСОД-содержащие полоски становятся прозрачными. Проявленный гель сканировали с помощью Epson Perfection 4990 PHOTO (Epson, США) и анализировали насыщенность полос в программе ImageJ (NIH, США).

2.7 Определение активности каталазы

Белок выделяли по методу, описанному выше (Раздел 2.5). Активность каталазы определяли биохимическим путем на спектрофотометре по скорости деградации пероксида водорода по методу, предложенному Aebi и соавторами [257]. Принцип метода основан на том, что активность каталазы рассчитывается исходя из скорости распада Н₂О₂. В кювете смешивали известные количества образца и Н₂О₂ и измеряли оптическую плотность при 240 нМ. Поскольку каталаза разрушает Н₂О₂, то чем выше была активность каталазы в образце, тем быстрее снижалась концентрация Н₂О₂ в кювете.

2.8 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени

Клетки лизировали в тризоле и затем выделяли РНК с помощью набора “Direct-zol^TM RNA MiniPrep Kit” согласно инструкции производителя (Zimo Research Corp., США). Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали с помощью набора “High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit” (Applied Biosystems, США). Количественную ПЦР в режиме реального времени (45 циклов) проводили на приборе StepOne™ System (Applied Biosystems, США) с использованием красителя SYBR Green и праймеров. Последовательности праймеров представленных в Таблице 1. Данные анализировали в программе StepOne™ Software v2.2 (Applied Biosystems, США) и Microsoft Excel (Microsoft, США). Результаты представлены в виде относительных значений экспрессии (2^?ДДCt), где Ct - значение порогового цикла реакции.

2.9 Статистическая обработка результатов

Результаты измерений, проведенных в 3-5 параллельных пробах, представлены в виде “среднее значение ± стандартное отклонение”. Статистическая значимость определяли с помощью одномерного дисперсионного анализа с последующим тестом на наименьшую значимую разность и тестом на взвешенное среднее Тьюки. Данные тесты используются для сравнения и определения разницы между и в пределах групп данных в зависимости от значений среднего и среднеквадратических ошибок для каждой переменной. Гомогенность дисперсии бралась в пределах доверительного интервала в 95%. Результаты со значениями P<0.05 принимались как статистически значимые.

Таблица 1. Последовательности праймеров для ПЦР в реальном времени.