В нескольких независимых лабораториях было показано, что ДНК-связывающий домен некоторых факторов транксрипции (р53, NF-kB, AP-1, c-Myb, Ets, Sp-1, Egr-1 и др.) содержит консервативные цистеины, замещение или удаление которых приводит к нарушению редокс-регуляции и изменению активности/функции белка (см. [161] и ссылки в нем). Например, замещение консервативных цистеинов в молекуле опухолевого супрессора р53 приводит к снижению его ДНК-связывающих способностей. Неспособный связываться с ДНК белок не может выполнять свои функции фактора транскрипции и опухолевого супрессора, что часто приводит к трансформации клетки и чрезмерной пролиферации [162, 163]. Сходным образом замещение цистеинов в молекулах NF-kB и АР-1 и нарушение их редокс-регуляции способствует абберантной пролиферации и развитию опухолей [164, 165].
Показано, что промотор циклина D1, важного регулятора прогрессии клетки через G1 фазу, содержит сайты связывания редок-регулируемых факторов транскрипции, таких как NF-kB, AP-1, Sp-1 и др, то есть экспрессия циклина D1 зависит от состояния внутриклеточного редокс-статуса [166]. В условиях окислительного стресса происходит глутатионилирование c-Jun, одной из субъединиц АР-1, по Cys269, который находится в сайте связывания ДНК. Глутатионилирование ДНК-связывающего домена ингибирует активность АР-1 и репрессирует экспрессию циклина D1. В опухолевых клетках часто происходит мутация Cys269 и его замена на серин, что приводит к потере редокс-регуляции и абберантной пролиферации [167]. Чувствительность к состоянию редокс-статуса была также показана для c-Myb и NF-Y, регулирующим транскрипцию циклинов В1 и А. Фактор транскрипции b-Myb содержит семь редокс-чувствительных цистеинов. Смещение окислительно-восстановительного равновесия в более окисленное состояние с помощью окислителя диамида значительно снижало активность b-Myb, приводя к нарушению связывания транскрипционного фактора с ДНК. Интересно отметить, что повышенный уровень b-Myb часто встречается в опухолевых клетках. Как отмечалось выше, большинство опухолевых клеток характеризуется повышенным содержанием АФК, что возможно и приводит к нарушению регуляции пролиферации с помощью b-myb [168]. Фактор транскрипции NF-Y на 30% существует в виде неактивных димеров. Добавление восстановителя, дитиотреитола, к NF-Y способствовало усилению связывания NF-Y с ДНК. Замещение Cys85 и Cys89 в молекуле NF-Y на серины приводило к тому, что NF-Y присутствовал только в форме мономеров и его активность не зависела от дитиотреитола [169].
Рисунок 1.3. Редокс-регуляция клеточного цикла. Из [152] с изменениями, см. пояснения в тексте.
Повышение уровня GSH при обработке мышиных фибробластов, находящихся в ранней G1 фазе, с помощью NAC приводило к нарушению прогрессии клеточного цикла, увеличению количества клеток в G1 фазе и снижению количества клеток в S фазе. Нарушению прогрессии клеточного цикла предшествовало уменьшение уровня циклина D1, увеличение уровня р27, ингибитора Cdk4/6, и дефосфорилирование рRb, что указывало на зависимость уровня циклина D1, р27 и рRb от состояния редокс-статуса. После удаления NAC из среды наблюдали кратковременный скачок прооксидантного уровня (Н2О2) и возобновление прогрессии клеточного цикла [170]. Полученные данные указывали на необходимость присутствия небольших количеств Н2О2 для перехода клеток из G1 в S фазу клеточного цикла.
Подобно действию NAC, усиление экспрессии каталазы или GPx, катализаторов разложения Н2О2, приводило к снижению внутриклеточного уровня Н2О2 и остановке клеточного цикла в G1 фазе [63, 171, 172]. Обработка Her1 фибробластов с помощью Н2О2, наоборот, повышала уровень циклина D1, что предположительно было результатом ингибирования деградации циклина D1 [173]. Несмотря на то, что повышенный уровень GSH ингибировал прогрессию клеточного цикла, полное удаление тиолов из среды также препятствовало переходу клеток в S фазу. Удаление тиолов из среды культивирования лимфоцитов, препятствовало экспрессии и фосфорилированию рRb под действием IL-2. Добавление GSH, NAC и 2-меркаптоэтанола обращало этот эффект [174]. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что хотя небольшое увеличение уровня АФК необходимо для активации рRb, чрезмерное повышение прооксидантного уровня приводит к нарушению клеточного цикла.
Дальнейшее исследование роли GSH и АФК в регуляции клеточного цикла выявило, что снижению экспрессии циклина D1 в клетках, обработанных NAC, предшествовало повышение уровня О2*-. Инкубация клеток с Tiron, ловушкой для О2*-, препятствовало нарушению прогрессии клеточного цикла под действием NAC, указывая на то, что О2*- может оказывать ингибирующее действие на экспрессию циклина D1 [175]. Однако, снижение уровня О2*- с помощью темпола, препятствовало накоплению циклина А, регулятора G1/S перехода, и прогрессии через S фазу, приводя к остановке клеточного цикла в поздней G1 фазе. Удаление темпола из среды способствовало восстановлению прогрессии клеточного цикла. Эти данные указывают на необходимость присутствия О2*- для перехода клетки из G1 в S фазу. Повышенная экспрессия Emi1, ингибитора комплекса APC/Cdh1, отменяла эффект темпола. Клетки экспрессирующие Emi1, демонстрировали уровень циклина А сравнимый с контролем и отсутствие блока в G1 фазе. К сходным результатам приводило применение ингибиторов 26S протеасомы. Как было отмечено выше убиквитинирование циклина А с помощью комплекса APC/Cdh1 в течение G1 фазы препятствует переходу в S фазу. Исходя из имеющихся данных можно предположить, что О2*- играет важную роль в ингибировании APC/Cdh1 и поэтому его присутствие необходимо для перехода в S фазу. Таким образом, было показано, что повышение уровня АФК при прогрессии из G1 в S необходимо для ингибирования деградации циклина А под действием АРС [176]. Отсюда следует, что присутствие О2*- в начале G1 фазы ингибирует экспрессию циклина D1 и приводит к остановке клеточного цикла. Однако в конце G1 фазы, О2*- необходим для прогрессии из G1 в S. Кажущаяся несогласованность является лишь еще одним доказательством существования редокс-цикла внутри клеточного цикла, а также подчеркивает сложность и важность редокс-модификаций для регуляции пролиферации.
Еще один фермент S фазы, топоизомераза II, играет важную роль в поддержании целостности ДНК, путем распутывания переплетенных в процессе репликации сестринских хроматид и способствуя релаксации ДНК. Goswami et al показали, что уровень мРНК топоизомеразы варьирует в зависимости от фазы клеточного цикла достигая максимума в S фазе. Дальнейшие исследования выявили, что экспрессия топоизомеразы II регулируется за счет взаимодействия 3`-UTR последовательности мРНК с редокс-чувствительными белками [32, 57].
Фосфатаза Cdc25С, важный регулятор прогрессии клеточного цикла через G2 фазу, содержит в активном центре цистеин (Cys377) и поэтому чувствителен к изменениям редокс-статуса. Образование связи между Cys377 и Cys330 приводит к усилению связывания Cdc25С с белком 14-3-3, что препятствует перемещению Cdc25С в ядро и активации комплекса циклин В1/Cdk1 (см. Рис. 1.4) [138, 177]. В независимом исследовании было показано, что обработка клеток Н2О2 приводит к инактивации Cdc25C, в то время как белок мутантный по Cys377 и Cys330 был нечувствителен к действию Н2О2. [177, 178]. Как было отмечено выше, уровень GSH возрастает по мере приближения к митозу [148], это вероятно способствует переходу Cdc25C в более стабильное состояние и активации циклин В/Cdk1.
Рисунок 1.4. Редокс-регуляция активности Cdc25C фосфатазы. Из [177] c изменениями. См. пояснения в тескте.
Chang et al. показали, что в G2 фазе активная CDK1 фосфорилирует пероксиредоксин I , внутриклеточный фермент катализирующий деградацию Н2О2, ингибируя его активность. Накопление Н2О2, в результате снижения активности пероксиредоксина I, представляется необходимым для прогрессии через G2 фазу в М [179]. Как было отмечено выше, активность MnСОД снижается по мере прогрессии клеточного цикла от G1 к М фазе, способствуя повышению уровня АФК. Повышение экспрессии MnСОД в клетках карцином усиливало формирование индуцированного радиацией G2 блока, указывая на то, что высокий уровень MnСОД препятствует прогрессии клеток через G2 фазу [180]. Другой внутриклеточный антиоксидант, витамин С, также был способен индуцировать G2 блок в клетках карциномы HeLa и глиобластомы T98G человека. Индукция G2 блока под действием витамина С сопровождалась усилением экспрессии циклина В1 и снижением уровня активного Cdc25С, активатора комплекса циклин В1/CDK1 [181].
Присутствие редокс-чувствительных цистеинов в молекулах убиквитин-активирующего (Е1) и убиквитин-коньюгирующего (Е2) предполагают существование редокс-регуляции процессов деградации белка. Повышение уровня восстановленного глутатиона (GSH) ингибировало активность Е1 и Е2 [182], а также 20S субъединицу протеасомы, препятствуя протеолизу белка [183]. Н2О2, наоборот, стимулировал процессы убиквитинирования, за счет усиления экспрессии E2 и убиквитин-лигазы (Е3) [184].
Резюмируя сказанное выше, важно подчеркнуть следующее: прогрессия клеточного цикла сопровождается не только изменениями уровня циклинов и активности CDK, но и колебаниями соотношения про- и антиоксидантов внутри клетки (окислительно-восстановительного баланса). Исходя из этого, было предположено существование т.н. редокс-цикла внутри клеточного цикла и тесно с ним взаимосвязанного. Пертурбации внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса ведут к нарушениям прогрессии клеточного цикла, указывая на возможность регуляции пролиферации через модуляцию редокс-статуса клетки.
РАЗДЕЛ 1.3 Современное состояние знаний о противоопухолевом эффекте короткоцепочечных пептидов
1.3.1 Карнозин и его производные. Общая характеристика
Карнозин представляет собой природный короткоцепочечный пептид, состоящий из двух аминокислот - в-аланина и L-гистидина. В организме человека карнозин представлен во многих тканях (мышцы, мозг, печень, ткани глаза, желудок, почки, легочная ткань), достигая наиболее высокой концентрации в скелетных мышцах (~ 20 мM) и в обонятельных луковицах головного мозга (~ 2.5 мM) [1, 2].
Карнозин синтезируется с помощью фермента карнозин-синтетазы [3-6], которая катализирует образование пептидной связи между в-аланином и L-гистидином, используя энергию АТФ и ионы Mg2+:
в-аланин + L-гистидин + АТФ = карнозин + Pi + АДФ [7]
Карнозин-синтетаза относится к семейству ATP-grasp ферментов, катализирующих АТФ-зависимое присоединение карбоксила одной молекулы к амино- или тиоловой группе другой с образованием АДФ и органического фосфата (Pi) [185]. Ген карнозин-синтетазы располагается в 11q13 хромосоме человека и экспрессируется главным образом в мозге и мышцах [7]. Bauer et al. показали, что карнозин и его производные синтезируется в основном клетками глии. Интересно, что опухолевые клетки, глиомы С6, тоже активно синтезировали карнозин и родственные соединения [186]. Синтез карнозина в нейронах обнаружен не был, однако нейроны были способны поглощать карнозин из среды и метаболизировать его [187-190]. Интересно отметить, что усиление синтеза карнозина сопровождалось дифференцировкой глиальных клеток, что оценивалось по усилению иммуноокрашивания антителами к маркерам дифференциации [189]. Сходный эффект наблюдали при обработке скелетных мышц новорожденных цыплят. Усиление синтеза карнозина замедляло скорость деления клеток и способствовало превращению миобластов в миотубулы [191, 192].
В организме человека существует два фермента, способных расщеплять карнозин на составные аминокислоты: сывороточная (CN1) [193] и тканевая/цитозольная (CN2) карнозиназы [194, 195]. CN1 экспрессируется главным образом в мозге, и в меньшей степени в печени. Иммуногистохимическое исследование выявило присутствие CN1 в цитозоле пирамидальных нейронов гиппокампа, а также в больших и малых нейронах коры больших полушарий. Цитозольная фракция клеток, секретирующих CN1, не деградировала карнозин, указывая на то, что CN1 относится к секретируемым белкам и активен только после секреции [9]. В отличие от CN1, CN2 экспрессируется повсеместно в тканях человека и является цитозольным ферментом. Больше всего этого фермента содержится в почках и печени, в меньшем количестве обнаружен в мозге, селезенке и поджелудочной железе, следовые количества - в легких, семенниках и яичниках, отсутствует в сердце [9]. Ферменты характеризуются разными рН-оптимумами работы. CN1 демонстрирует наибольшую активность при рН 7,5 - 8,5, CN2 характеризуется более узким оптимумом работы рН с максимумом около рН 9,5. Таким образом, при физиологических pH карнозин гидролизуется преимущественно с помощью CN1 [9]. Интересно отметить, что экспрессия CN1 отсутствует в пренатальном периоде и у новорожденных, что указывает на усиление экспрессии CN1 с возрастом [9, 196]. Кроме того, у пожилых людей обнаружен более низкий уровень гомокарнозина в сыворотке крови по сравнению с молодым поколением [197].
У карнозина существует несколько природных производных, в том числе: N-ацетил-карнозин (N-ацетил-в-аланил-L-гистидин), анзерин (в-аланил-1-метил-L-гистидин) и гомокарнозин (у-амино-бутирил-L-гистидин) (см. Рис. 1.5). Считается, что в-аланил-содержащие дипептиды преимущественно располагаются в скелетных мышцах, в то время как дипептиды содержащие г-амино-масленную кислоту (ГАМК) типичны для центральной нервной системы [7]. Ацетилированная форма карнозина присутствует в сердечной мышце и в мозге [198]. Предполагается, что образование ацетилкарнозина происходит за счет ацетилирования карнозина, однако информация о ферментах, катализирующих данную реакцию пока отсутствует. Гомокарнозин (0,3-1,5 мМ [199]) синтезируется в мозге из ГАМК и L-гистидина с помощью карнозин-синтетазы. Однако скорость синтеза гомокарнозина при прочих равных условиях гораздо медленнее, чем для карнозина [5, 7]. Синтез анзерина (до 40 мМ в мышцах птиц [200]) происходит в мышцах позвоночных животных путем метилирования карнозина с помощью метилтрансферазы [201]. Анзерин не обнаружен в организме человека. Расщепление производных карнозина осуществляет сывороточная карнозиназа (CN1), при этом скорость гидролиза гомокарнозина составляет 11% от скорости гидролиза карнозина или анзерина [202].