Дипломная работа: Антипролиферативное действие карнозина и его производных на опухолевые клетки нейрального происхождения

G₁ фаза. В G₁ фазе происходит активный рост новообразованной дочерней клетки, проверяется целостность и равномерность распределения хромосом после митоза. Первым под действием митотического сигнала активируется экспрессия циклинов D (в частности D1), которые образуют комплексы с CDK 4 или CDK 6 [110]. Главная роль комплекса циклин D1/CDK4/6 заключается в фосфорилировании белка ретинобластомы (retinoblastoma tumor suppressor protein, рRb) и активация фактора транскрипции E2F. В отсутствии митотической стимуляции E2F связан с pRb и поэтому не активен. Фосфорилирование pRb приводит к конформационным изменениям в молекуле pRb и освобождению E2F [111]. E2F связывается со специфической последовательностью ДНК и активирует экспрессию большого количества разнообразных генов необходимых для входа в S фазу, среди них циклины Е и А, ДНК полимераза, белок-ингибитор раннего митоза (early mitotic inhibitor, Emi1) и др. [112]. В конце G₁ фазы циклин D1 разрушается, что приводит к ингибированию связанных с ним CDK. Разрушение циклина D1 происходит с помощью киназы гликогенсинтетазы (GSK-3в), которая фосфорилирует циклин D1 по Thr286, или с помощью Mirk/dyrk киназы, которая фосфорилирует циклин D1 по Thr288. В обоих случаях фосфорилирование влечет за собой деградацию циклина в протеасомах [113, 114]. Ингибирование экспрессии циклина D1 препятствует переходу клеток в S фазу. В то время как эктопическая экспрессия циклина D1 ускоряет прогрессию через G₁ фазу [115].

Интересно отметить, что для перехода из G₁ фазы в S, также необходима активация ERK1/2 с последующей транслокацией протеинкиназы в ядро. Показано, что ERK1/2 индуцирует экспрессию циклина D1, предположительно, через активацию экспрессии генов семейства Fos и Myc. Экспрессия Fos запускается с помощью ERK-активируемого фактора транскрипции Elk. Фосфорилирование Myc по Ser62 с помощью ERK1/2 увеличивает стабильность Myc, который способен напрямую индуцировать экспрессию циклина D1 [106].

В конце G₁ фазы находится т.н. точка “Старт” (Start или Restriction point) - контрольная точка, в которой оценивается готовность клетки и благоприятность внешних условий (наличие питательных веществ, факторов роста и др.) к переходу в S фазу и удвоению ДНК. Прошедшая через “Старт” клетка - запрограммирована на репликацию и больше не зависима от внешних стимулов.

К концу G₁ фазы возрастает количество циклина Е, который образует комплекс с CDK2. Фосфатаза Cdc25A дефосфорилирует CDK2 по p-Tyr15 и p-Thr14, активируя комплекс циклин Е/CDK2, необходимый для продвижения клетки из G₁ в S [116]. Как только клетки входят в S фазу циклин Е деградирует и CDK2 соединяется с циклином А [81, 110]. Циклин А не накапливается в клетке вплоть до поздней G₁ фазы из-за убиквитинирования под действием АРС. Циклины D и Е нечувствительны к действию АРС. Перед входом в S фазу Emi1, экспрессия которого запускается с помощью E2F, ингибирует АРС, способствуя стабилизации циклина А и активации СDK2. [117].

S фаза. Основным событием S фазы является удвоение ДНК (репликация) и хроматина. Репликация может начинаться только в определенных местах - точках начала репликации (origins of replication, OR), которые разбросаны по всей ДНК. Подготовка к репликации начинает еще в конце митоза - начале G₁ фазы, когда в точках начала репликации собираются т.н. пререпликационные комплексы (pre-RC), состоящие из большого количества белков необходимых для инициации репликации. Эта стадия часто называется лицензированием (licensing) точек начала репликации, т.к. синтез ДНК может происходить только в OR содержащих pre-RC. В S фазе активный комплекс циклин А/CDK2 запускает сборку преинициирующих комплексов вокруг компонентов pre-RC. Преинициирующие комплексы раскручивают спираль ДНК подготавливая место посадки ДНК, полимеразы и других ферментов репликации. Сразу после репликации OR комплекс pre-RC разбирается под действием циклин А/CDK2. Сборка новых pre-RC в S фазе невозможна из-за присутствия активных СDK, что препятствует множественной репликации [118, 119]. Репликация хромосом состоит из репликации ДНК и репликации хроматина. Основную массу хроматина составляют белки гистоны. Циклин А/CDK2 индуцирует синтез гистонов, поставляя материал для упаковки новосинтезированной ДНК. К концу S фазы каждая хромосома состоит из двух пар идентичных сестринских хроматид. Каждая пара сестринских хроматид связана между собой комплексами белков, когезинами, которые регулируют процесс разделения сестринских хроматид при митозе [120].

G₂ фаза. Прохождение клетки через G₂ фазу и вход в митоз регулируется комплексом циклина В/CDK1 [121]. На сегодняшний день семейство циклинов В состоит из 5 белков - циклины В1, В2, В3, В4 и В5, из которых В1 является наиболее охарактеризованным [122]. Промотор циклина В1 содержит сайты связывания для множества транскрипционных факторов, в том числе B-Myb, NF-Y, USF, p53, p21, Ap-1, Ap-2, Ets-1 и др. [123]. Экспрессия гена циклина В1 наблюдается на протяжении всего клеточного цикла, однако в G₂ уровень циклина В1 в 50 раз больше, чем в G₁. Наивысшего уровня циклин В1 достигает в конце G₂ фазы - начале митоза [124]. В середине митоза уровень циклина В1 резко снижается за счет работы АРС и остается низким до поздней S фазы, когда происходит ингибирование АРС с помощью Emi1 и комплекса циклин А/CDK2 [117, 125]. Усиление экспрессии циклина В1 приводит к его накоплению в цитоплазме, достигнув определенной концентрации циклин В связывается с CDK1. Образовавшийся комплекс циклин В1/CDK1 перемещается в ядро [126]. Транслокация циклин В1/CDK1 в ядро возможна только при фосфорилировании 5 серинов в сайте удерживающем циклин В1 в цитоплазме (cytoplasmic retention site, CRS): Ser116, Ser26, Ser128, Ser133 и Ser147 [126]. Показано, что ингибирование ERK1/2 препятствует фосфорилированию CRS, что приводит к удерживанию комплекса циклин В1/CDK1 в цитозоле [127]. Yang et al. предполагают, что CRS циклина В1 является частью последовательности для экспорта белка в ядро (nuclear export sequences, NES), с помощью которой циклин В1 взаимодействует с экспортирующим ядерным рецептором (chromosome region maintenance 1, CRM1) [128]. Однако комплекс остается неактивным, потому что протеинкиназы Wee1 и Myt1 фосфорилируют CDK1 по Thr14 и Tyr15, ингибируя активность CDK1. Wee1 находится в ядре, а Myt1 - на цитоплазматической стороне мембраны эндоплазматического ретикулума [129-131]. Интересно отметить, что активация ERK1/2 снижает активность Myt1 через активацию RSK, непосредственного субстрата ERK1/2, который фосфорилирует и ингибирует Myt1, приводя к остановке клеточного цикла в G₂/M [132]. Для активации комплекса циклин В/CDK1 необходима фосфатаза Cdc25С, которая дефосфорилирует CDK1, убирая ингибирующие фосфаты [133, 134]. Активированный циклин В/CDK1 запускает события раннего митоза [129]. Параллельно с активацией циклин В/CDK1 происходит ингибирование Wee1 и Myt1. В течение интерфазы Cdc25C-associated protein kinase (C-TAK1) фосфорилируют Cdc25С по Ser216, что способствует его связыванию с белком 14-3-3 [135-137], который удерживает Cdc25С в цитоплазме, препятствуя перемещению фосфатазы в ядро и активации циклин В/CDK1 [138, 139]. Активирующаяся в ответ на повреждение ДНК Chk1 киназа тоже способна фосфорилировать Cdc25С, приводя к ингибированию фосфатазы и остановке прогрессии клеточного цикла [138, 140, 141].

Митоз. Основная задача митоза - равномерное распределение содержимого материнской клетки между двумя дочерними. Митоз состоит из нескольких подфаз (профаза, прометафаза, метафаза, анафаза, телофаза) и заканчивается цитокинезом, делением клетки надвое. События раннего митоза (профаза, прометафаза, метафаза) запускаются активированным во время G₂ фазы комплексом циклин В/CDK1. Циклин В/CDK1 фосфорилирует субъединицы белка конденсина, это стимулирует свертывающую активность конденсина и инициирует конденсацию хромосом. Параллельно активируется сборка митотического веретена деления. Фосфорилирование белков, входящих в состав комплексов ядерных пор и ламины, приводит к разрушению ядерной оболочки. В конце метафазы циклин В/CDK1 активирует АРС. Клетки не входят в анафазу (не происходит разделения хроматид) до тех пор, пока все хромосомы не прикрепятся к веретену деления. Неприкрепленные хроматиды блокируют разделение хроматид. Это происходит, вероятно, за счет того, что неприкрепленные кинетохоры посылают сигнал АРС, блокирующий его активность [142]. Активность АРС регулируется с помощью двух дополнительных белков Cdc20 и Cdh1, которые выполняют функцию субстрат-специфических связывающих доменов. Циклин В/CDK1 фосфорилирует АРС, приводя к образованию комплекса АРС/Cdc20 и усилению активности АРС. АРС/Cdc20 ингибирует АРС/Cdh1 за счет фосфорилирования Cdh1. АРС/Cdc20 убиквитинирует белок секурин, что ведет к его деградации и активации протеолитического фермента, сепаразы, разрушающей комплексы когезинов, инициируя разделение хромосом и их расхождение к полюсам деления. Помимо участия в расхождении хромосом, АРС инициирует деградацию всех циклинов, приводя к инактивации всех CDK и дефосфорилированию их мишеней. Эти изменения необходимы для завершения митоза - разрушения веретена деления и цитокинеза. Деградация циклина В приводит к инактивации комплекса циклин В/CDK1, а, следовательно, и стимула активирующего АРС/Cdc20. Снижение АРС/Cdc20 в конце митоза способствует увеличению активности АРС/Cdh1. АРС/Cdh1 также как и АРС/Cdc20 убиквитинирует циклины приводя к их деградации [98]. В результате период времени от анафазы до поздней G₁ является периодом инактивации CDK. Этот период необходим, так как сдерживает какое то время клетку от вступления в новый клеточный цикл. Некоторые клетки никогда не входят в клеточный цикл оставаясь в т.н. фазе покоя - G₀, экспрессия генов циклинов и CDK в них подавлена [80].

Подводя итог вышесказанному, важно отметить следующее: пролиферация представляет собой последовательность переходов от G₁ фазы клеточного цикла к S, G₂ и митозу. События каждой фазы запускаются путем фосфорилирования определенных белков с помощью циклин-зависимых киназ. Активность циклин-зависимых киназ регулируется с помощью синтеза/деградации их функциональных субъединиц, циклинов, а также фосфорилирования/дефосфорилирования самих киназ. На сегодняшний день в литературе накоплено множество данных о взаимосвязи между состоянием редокс-статуса клетки и функционированием некоторых белков-регуляторов клеточного цикла, что позволяет предположить существование редокс-регуляции клеточного цикла.

1.2.2 Редокс-регуляция клеточного цикла

Впервые существование редокс-регуляции клеточного цикла было упомянуто в работе Rapkine. Он наблюдал колебания уровня растворимых в трихлоруксусной кислоте тиолов по мере прогрессии клеточного цикла. Концентрация тиолов падала в течение подготовки к делению и возрастала по мере формирования митотического аппарата [143]. Позже Kawamura наблюдал усиление окраски тиоловых групп (-SH) белков по мере сборки веретена деления в яйцах морского ежа находящихся в профазе. Окрашивание оставалось интенсивным в метафазе, постепенно снижалось по мере продвижения клеток по анафазе и было почти незаметным в телофазе [144]. Mauro et al., используя синхронизированные клетки HeLa, наблюдали снижение концентрации несвязанных с белками -SH групп в G₁ фазе с последующим увеличением концентрации к концу S фазы. Концентрация восстановленных тиоловых групп в составе белков, наоборот, была максимальной в G₁ и постепенно снижалась по мере прогрессии через S фазу [145]. Tu et al. продемонстрировали взаимосвязь между экспрессией генов и интенсивностью дыхательных процессов.

Экспрессия генов, кодирующих рибосомальные белки, факторы инициации трансляции и других регуляторов синтеза белка, происходила во время фазы активного дыхания, что, возможно, связано с потреблением большого количества энергии во время синтеза белка. Репликация ДНК и прогрессия клеточного цикла, наоборот, происходили в условиях пониженной дыхательной активности, что, вероятно, способствовало снижению окислительного повреждения ДНК под действием АФК, образующихся в большом количестве в процессе дыхания [146]. Существование взаимосвязи между редокс-статусом и синтезом белка было подтверждено в работе Jonas et al. При исследовании синтеза ДНК по интенсивности включения синтетического аналога тимина - 5-бром-2-дезоксиуридина (БДУ) было обнаружено, что при окисленном состоянии редокс-статуса скорость синтеза ДНК минимальна и значительно возрастает при смещении редокс-статуса в более восстановленное состояние [147].

Рисунок 1.2. Изменения активности MnСОД и уровня АФК по мере прогрессии клеточного цикла.

Проведенные в нескольких независимых лабораториях исследования выявили, что по мере прогрессии клеточного цикла от G₀/G₁ к митозу происходит увеличение уровня АФК. Концентрация АФК, измеренная по флуоресценции редокс-чувствительного красителя DCFH₂-DA, была максимальна в поздней S фазе, а также в G₂+M по сравнению с G₁ [26]. Параллельно с повышением АФК, увеличивался уровень основного редокс-буфера клетки - глутатиона (GSH) [148] - и достигал максимума в G₂ и M фазах по сравнению с G₁, что, вероятно, являлось ответной реакцией на рост АФК [47, 149]. Интересно отметить, что активность основного антиоксидантного фермента клетки - MnСОД - была максимальна в G₁ фазе и постепенно снижалась по мере прогрессии через S и G₂ фазы что, возможно, и являлось причиной роста АФК (см. Рис. 1.3) [27, 148, 150]. Более детальное исследование изменения уровня О₂*^- и Н₂О₂ по мере прогрессии клеточного цикла выявило, что О₂*^- повышен в G₁ фазе, а уровень Н₂О₂ увеличивается в G₂. Поскольку MnСОД играет важную роль в регуляции соотношение между О₂*^- и Н₂О₂, то было сделано предположение, что MnСОД выполняет роль переключателя пролиферативных процессов. Повышение активности MnСОД приводило к снижению уровня О₂*^-, увеличению уровня Н₂О₂ и усилению пролиферации. Снижение активности MnСОД сопровождалось ростом уровня О₂*^-, понижением уровня Н₂О₂ и замедлением пролиферации [27, 151]. Изменения внутриклеточного редокс-статуса при прогрессии клеточного цикла позволяют предположить существование т.н. редокс-цикла внутри клеточного цикла и тесно с ним взаимосвязанного. Причем, смещение редокс-статуса в более окисленное состояние сопровождается активацией пролиферации, а смещение редокс в более восстановленное состояние приводит к замедлению пролиферации [25, 152].

Молекулярные механизмы редокс-регуляции. С помощью комбинированного in vitro/биоинформатического анализа выявлено, что 92 из 1634 исследованных белков-регуляторов клеточного цикла содержат в своей структуре участки, способные модифицироваться в ответ на изменения редокс-статуса клетки. К редокс-чувствительным группам были отнесены тиольные группы цистеина и метионина (-SH), дисульфидные связи (-S-S-), ионы переходных металлов (Fe²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺ и др), сопряженные системы связей в белках-переносчиках электронов дыхательной цепи (Рис. 1.3). Окисление тиоловых групп с образованием дисульфидных связей под действием Н₂О₂ часто сопряжено с внутримолекулярными конформационными изменениями, приводящими к активации/инактивации молекулы (Рис. 1.3. А, Б). Изменение степени окисления металлов-кофакторов киназ и фосфатаз под действием О₂^-* часто приводит к ослаблению связей, удерживающих металл в комплексе с белком, диссоциации металла из комплекса и нарушению редокс-регуляции (Рис. 1.3. В, Г) [29, 149].

Показано, что взаимодействие некоторых митогенов (EGF, PDGF и др.) с их рецепторами на поверхности мембран сопровождается образованием небольшого количества Н₂О₂ [153, 154]. Добавление Н₂О₂ в отсутствии EGF или PDGF индуцировало внутриклеточный сигнал сходный с сигналом факторов роста. Каталаза и пероксиредоксин ингибировали Н₂О₂-индуцированный сигналинг [154-156]. Показано, что присутствие Н₂О₂ необходимо для фосфорилирования и активации МАР-киназы ERK1/2 [155, 157]. Интересно отметить, что молекула малой ГТФазы Ras, активатора ERK1/2, содержит редокс-чувствительные цистеины [158]. Модификации цистеинов в молекуле Ras под действием Н₂О₂ может быть одним из механизмов редокс-регуляции ERK1/2 [159]. Ингибирование образования Н₂О₂ с помощью NAC или GSH, а также усиление экспрессии MnСОД препятствовало активации ERK1/2 и дальнейшей передачи сигнала от рецепторов факторов роста к ядру [28, 160].

Рисунок 1.3. Примеры редокс-регулируемых модификаций в молекулах белков. Из [149] с изменениями. (А) Обратимое глутатионилирование остатка цистеина. (Б) Образование дисульфидной связи в молекуле тиоредоксина. (В) Взаимодействие электрона с изоаллоксазиновой сопряжённой циклической системой флавина - кофактора белка электронно-транспортной цепи. (Г) Окисленная иона железа в составе гемма. (Д) Диссоциация окисленного переходного металла (Х) из металлсвязывающего домена белка.