Дипломная работа: Антипролиферативное действие карнозина и его производных на опухолевые клетки нейрального происхождения

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ “НАУЧНЫЙ ЦЕНТР НЕВРОЛОГИИ” РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Антипролиферативное действие карнозина и его производных на опухолевые клетки нейрального происхождения

РЫБАКОВА ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Федорова Татьяна Николаевна

МОСКВА 2013

• СОДЕРЖАНИЕ
• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
• РАЗДЕЛ 1.1 Редокс-статус клетки определяется соотношением внутриклеточных про- и антиоксидантов
• 1.1.1 Активны формы кислорода и их значение в жизни клетки
• 1.1.2 Основные представители антиоксидантной системы клетки и их роль в поддержании редокс-статуса
• РАЗДЕЛ 1.2 Редокс-регуляция клеточной пролиферации
• 1.2.1 Клеточный цикл и его регуляция
• 1.2.2 Редокс-регуляция клеточного цикла
• РАЗДЕЛ 1.3 Современное состояние знаний о противоопухолевом эффекте короткоцепочечных пептидов
• 1.3.1 Карнозин и его производные. Общая характеристика
• 1.3.2 Антиоксидантные свойства карнозина и его производных
• 1.3.3 Эффект карнозина и его производных на пролиферацию нормальных и опухолевых клеток
• 1.3.4 Пинеалон. Общая характеристика и свойства
• ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
• 2.1 Культуры клеток
• 2.2 Исследуемые соединения
• 2.3 Исследование клеточной пролиферации
• 2.3.1 Время удвоения популяции
• 2.3.2 Эффективность посева и доля выживших клеток
• 2.4 Проточная цитометрия
• 2.4.1 Измерение уровня АФК
• 2.4.2 Определение доли мертвых клеток
• 2.4.3 Анализ клеточного цикла
• 2.4.4 Двухпараметрический анализ клеточного цикла
• 2.5 Иммуноблоттинг
• 2.6 Определение активности MnСОД
• 2.7 Определение активности каталазы
• 2.8 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени
• 2.9 Статистическая обработка результатов
• ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
• РАЗДЕЛ 3.1 Изучение характера действия карнозина на пролиферацию клеток
• 3.1.1 Карнозин снижает количество клеток РС-12 в культуре
• 3.1.2 Карнозин снижает уровень АФК в клетках культуры РС-12
• 3.1.3 Карнозин и его производные индуцируют накопление клеток РС-12 в S и G₂/М фазах клеточного цикла
• 3.1.4 Изучение воздействия синтетического трипептида пинеалона на клеточный цикл
• РАЗДЕЛ 3.2 Изучение механизма регуляции клеточного цикла под действием карнозина
• 3.2.1 Карнозин избирательно ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы
• 3.2.2 Карнозин снижает уровень АФК и индуцирует экспрессию MnСОД
• 3.2.3 Карнозин индуцирует G₂ блок и усиливает экспрессию циклина В1
• РАЗДЕЛ 3.3 Изучение функциональной нагрузки структурных элементов в молекуле карнозина при антипролиферативном эффекте
• РАЗДЕЛ 3.4 Возможности применения карнозина в радиотерапии
• ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
• ВЫВОДЫ
• СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Карнозин представляет собой природный дипептид, состоящий из двух аминокислот - в-аланина и L-гистидина. В организме человека карнозин представлен во многих тканях (мышцы, мозг, печень, ткани глаза, желудок, почки, легочная ткань) достигая наивысшей концентрации в скелетных мышцах (~ 20 мM) и в обонятельных луковицах головного мозга (~ 2.5 мM) [1, 2]. Карнозин синтезируется с помощью фермента карнозин-синтетазы, которая катализирует образование пептидной связи между в-аланином и L-гистидином используя энергию АФТ и ионы Mg²⁺ с использованием энергии АТФ [3-7]. Разрушение карнозина на составляющие его аминокислоты осуществляется главным образом сывороточной карнозиназой (CN1) [8, 9].

Карнозин демонстрирует многообразие функций, приведем некоторые из них. Во время интенсивной мышечной работы карнозин выполняет функцию протонного буфера, связывающего избыток протонов, образующихся вместе с молочной кислотой, и препятствующего развитию ацидоза [10]. Карнозин также способен образовывать комплексы с металлами переменной валентности (Cu²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺ и др.) [11-13]. Антиоксидантные свойства карнозина заключаются в его способности образовывать комплексы с двумя высоко реакционноспособными окислителями - гидроксильным радикалом и супероксидным анионом, снижая их реактивность и предотвращая дальнейшее распространение окислительного повреждения [14-17]. Кроме того, в нескольких независимых исследованиях было продемонстрировано эффективное подавление накопления продуктов перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид, пероксильные радикалы, ненасыщенные альдегиды, 4-гидроксиноненаль) в присутствии карнозина, что снижало уровень окислительного повреждения макромолекул, способствуя сохранению их структуры и функций [15, 18, 19].

Антипролиферативный эффект карнозина на опухолевые клетки был впервые описан Nagai и Suda в 1986 году [20]. В их работе подкожные инъекции карнозина мышам линии ddY, с предварительно вживленными клетками саркомы, способствовали снижению интенсивности пролиферации опухолевых клеток и увеличению выживаемости животных. Позже в независимом исследовании Renner et al. на мышах с ксенографтами HER2/neu NIH3T3 фибробластов показали, что ежедневные внутрибрюшинные инъекции карнозина существенно подавляют пролиферацию злокачественных клеток и опухолевый рост [21]. Holliday и McFarland продемонстрировали избирательность действия карнозина на опухолевые клетки. Добавление карнозина к смеси клеток карциномы (HeLa) и нормальных человеческих фибробластов (MRC-5) приводило к выборочному уничтожению HeLa клеток и удлиняло продолжительность жизни фибробластов [22, 23]. Обработка карнозином нормальных эмбриональных стволовых клеток и злокачественных клеток эмбриональной терато-карциномы также приводило к избирательной гибели последних. Полученные данные указывали на то, что ни степень дифференцировки, ни скорость пролиферации клеток не являются определяющими факторами избирательного действия карнозина на опухолевые клетки. Несмотря на наличие большого количества экспериментальных данных об антипролиферативном действии карнозина на опухолевые клетки, механизм противоопухолевого эффекта остается не выясненным.

На сегодняшний день в литературе накоплено множество данных о том, что интенсивность пролиферации зависит от соотношения про- и антиоксидантов внутри клетки [24, 25]. Показано, что быстро пролиферирующие клетки характеризуются более высоким содержанием прооксидантов и пониженной активностью антиоксидантной системы по сравнению с клетками, делящимися медленно или находящимися в состоянии покоя [26, 27]. Было показано, что уровень прооксидантов в опухолевых клетках часто превышает прооксидантный уровень в нормальных клетках того же типа, что возможно является причиной их чрезмерной пролиферации [28, 29]. Добавление небольших концентраций прооксиданта пероксида водорода усиливало пролиферацию клеток [28], а повышение экспрессии антиоксидантного фермента MnСОД, наоборот, приводила к замедлению пролиферации [30]. Поскольку карнозин демонстрирует эффективные антиоксидантные свойства, мы предположили, что ингибирование пролиферации опухолевых клеток происходит в результате снижения уровня внутриклеточных прооксидантов под действием карнозина.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГБУ “НЦН” РАМН в рамках темы №146 “Исследование в условиях in vitro и in vivo проблем эффективности безопасности наноструктурных комплексов, обладающих нейропротекторным действием”.

Цель исследования. Изучение механизма антипролиферативного действия карнозина и его производных на опухолевые клетки нейрального происхождения.

Задачи исследования:

1. Изучить характер воздействия карнозина на пролиферацию культур опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (РС-12), карциномы горла и рта (FaDu, Cal27) и молочной железы (MB231) человека, глиобластомы человека (U-118-MG);

2. Выявить, сопровождаются ли индуцируемые карнозином изменения пролиферации опухолевых клеток колебаниями внутриклеточного уровня АФК и антиоксидантных ферментов;

3. Выяснить, являются ли индуцируемые карнозином изменения пролиферации опухолевых клеток результатом модификации прогрессии клеточного цикла;

4. Сравнить антипролиферативные свойства карнозина с действием его производных, а также синтетического трипептида пинеалона;

5. Оценить эффект совместного применения карнозина и ионизирующего излучения на гибель опухолевых клеток.

Научная новизна. Настоящая работа представляет собой оригинальное экспериментальное исследование, в котором было впервые показано избирательное подавление пролиферации клеток глиобластомы под действием карнозина. Установлено, что замедление пролиферации глиобластомы сопровождается накоплением клеток в G₂ фазе клеточного цикла и активацией экспрессии циклина B1. Продемонстрировано, что параллельно с изменениями в прогрессии клеточного цикла происходит повышение активности MnСОД и понижение внутриклеточного уровня АФК. Выявлено, что метилированное производное карнозина - анзерин - подавляет пролиферацию глиобластомы эффективнее, чем карнозин. Показано, что предварительная инкубация клеток с карнозином снижает выживаемость клеток глиобластомы под действием ионизирующего излучения. карнозин опухолевый клетка пинеалон

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты существенно расширяют представления о природе антипролиферативного действия карнозина на опухолевые клетки нейрального происхождения, что важно для понимания молекулярных механизмов действия карнозина в целом. Полученные в работе данные об эффекте совместного действия карнозина и ионизирующего излучения на выживаемость клеток глиобластомы открывают перспективу для применения карнозина в комбинированной терапии опухолей головного мозга.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Карнозин ингибирует пролиферацию опухолевых клеток нейрального происхождения, при этом наиболее выраженный эффект проявляется на клетках глиобластомы человека U-118-MG;

2. Ингибирование пролиферации клеток глиобластомы под действием карнозина сопровождается снижением уровня АФК и увеличением активности MnСОД;

3. Изменения в антиоксидантной системе клеток глиобластомы сопровождаются накоплением клеток в G₂ фазе клеточного цикла и усилением экспрессии циклина В1;

4. Метилированное производное карнозина, анзерин, ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы эффективнее, чем карнозин;

5. Предварительная инкубация клеток с карнозином снижает выживаемость клеток глиобластомы под действием ионизирующего излучения.

Протокол диссертационного исследования “Антипролиферативное действие карнозина и его производных на опухолевые клетки нейрального происхождения” было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ “НЦН” РАМН. Протокол №12/13 от 11.12.2013.

Апробация работы. Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании научных сотрудников ФГБУ “Научный центр неврологии” РАМН 18 октября 2013 года.

Материалы диссертационной работы были представлены на V Stromboli Conference on Cancer and Ageing: “The Primeval Life-Generating Molecules. Therapeutic and Aging-Reversing Properties” (Стромболи, Италия, 2010) и The 4th Quadrennial Meeting of the World Federation of Neuro-Oncology held in conjunction with the 2013 SNO Scientific Meeting and Education Day (Сан-Франциско, США, 2013)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, из них 1 публикация в изданиях, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ и 2 работы в зарубежных рецензируемых журналах.

Личный вклад автора. Автором лично выполнено культивирование клеточных линий и исследования клеточной пролиферации, проведено измерение уровня АФК, доли мертвых клеток, а также анализ клеточного цикла, определена активность и экспрессия антиоксидантных ферментов. Выполнена последующая аналитическая обработка и обобщение полученных результатов, сформулированы выводы и подготовлены публикации.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 120 стр. машинописного текста, 1 таблицу и 29 рисунков. Список литературы включает 271 источник (18 отечественных и 253 зарубежных).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

РАЗДЕЛ 1.1 Редокс-статус клетки определяется соотношением внутриклеточных про- и антиоксидантов

1.1.1 Активные формы кислорода и их значение в жизни клетки

Наиболее распространенные и реакционноспособные прооксиданты в клетке - активные формы кислорода (АФК). АФК представляют собой продукты частичного восстановления кислорода, содержащие один или несколько неспаренных электронов, и относятся к классу свободных радикалов [31].

Главным источником АФК в клетке является дыхательная цепь митохондрий [32], где теряется порядка 2% супероксида. Помимо этого АФК образуются при работе некоторых ферментов (НАДФН-окcидаза [33], ксантиноксидаза [34], монооксигеназа, NO-синтаза [35] и др), метаболизме ксенобиотиков, активации дыхательного взрыва в лейкоцитах, под воздействием цитокинов, ионизирующего и УФ-излучения [36]. Образование АФК происходит в несколько стадий. Одноэлектронное восстановление кислорода приводит к формированию супероксидного аниона (или супероксида, О₂*^-), который сам по себе не является окислителем, а наоборот, по свойствам напоминает слабое основание. Поэтому при физиологическом pH супероксид присутствует частично в протонированной форме (НО₂*, pK_a = 4.8), которая является достаточно сильным окислителем [37]. НО₂* представляет собой, по сути дела, пероксильный радикал (ROO*) без радикала (R), и поэтому подобно ROO*, легко инициирует перекисное окисление липидов (ПОЛ), приводя к образованию новых форм АФК: продуктов ПОЛ, пероксильных (ROO*) и алкоксильных (RO*) радикалов [38]. Супероксид достаточно быстро дисмутирует с образованием пероксида водорода (Н₂О₂): О₂^-* + 2HО₂* 2O₂ + H₂O₂, (k=9,7x10⁷ M^-1*s^-1) [39]. Взаимодействие между супероксидом и пероксидом водорода (реакция Фентона) приводит к образованию гидроксильного радикала (HO*): 2О₂^-* + H₂О₂ + 2H⁺ 2HO* + 2HO^- + O₂. Сама по себе реакция идет очень медленно (k<0.1 M^-1*s^-1), однако значительно ускоряется в присутствии ионов переходных металлов (Fe²⁺, Cu²⁺ и др.) [40]. HO* является самым сильным окислителем в водных растворах, реагируя с огромной скоростью с любыми находящимися по близости молекулами (k ? 10⁹ - 10¹⁰ M^-1*s^-1 для соединений содержащих C, H, O, S, N) [37]. Описанные выше превращения можно обобщить в виде четырех простых реакций: