Рисунок 1.5. Структура карнозина и его производных. Из [203] изменениями.
В организме человека карнозин выполняет множество функций, среди которых: pH-буфер в мышцах [10], хелатор металлов переменной валентности (Fe, Cu, Zn, Co) [11-13, 204, 205], нейротрансмиттер в обонятельных луковицах [2, 6], антиоксидант [15-18, 206, 207], ингибитор опухолевого роста [20, 21, 23, 208-210].
1.3.2 Антиоксидантные свойства карнозина и его производных
Карнозин эффективно препятствовал окислению 2,5-бис(гидроксиметил)фурана (BHMF) и N,N-диметил-4-нитрозоанилин (RNO) под действием света в растворе, содержащем фотосенсибилизатор [211, 212]. BHMF и RNO представляют собой ловушки синглетного кислорода (1О2), ингибирование окисления ловушек с помощью карнозина указывает на способность карнозина взаимодействовать с 1О2. Кроме того, карнозин снижал интенсивность хемилюминесценции, индуцируемой синглетным кислородом, образующимся в смеси Н2О2+NaClO, подтверждая способность тушить 1О2 [213]. Интересно отметить, что при эквимолярных концентрациях эффективность тушения 1О2 карнозином была выше, чем у гистидина, известной ловушки для 1О2 [211, 212, 214]. Более высокая эффективность карнозина по сравнению с гистидином, возможно, связана с особенностями внутримолекулярных взаимодействий (влияние в-аланина), что приводит к большей реакционной способности гистидина в молекуле карнозина.
Методом синхронной регистрации светопоглощения при радиолизе водного раствора карнозина было выявлено образование комплекса между супероксидом и карнозином с частичным переносом заряда. Образование комплекса приводило к снижению константы скорости дисмутации О2-* и повышению его стабильности в водном растворе [14]. Способность карнозина взаимодействовать с супероксид анионом была подтверждена в независимой работе Klebanov et al, где карнозин препятствовал восстановлению нитро-голубого тетразолия под действием О2-* образованного в смеси ксантин+ксантиноксидаза [17]. Сравнение эффективности тушения О2-*, образующегося в смеси глутатион+пероксидаза+люминол, выявило, что карнозин и гистидин демонстрировали примерно одинаковую эффективность, в то время как в-аланин был неактивен, что указывает на определяющую роль гистидина при взаимодействии карнозина с супероксидом [215].
С помощью метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) было продемонстрировано, что добавление карнозина к смеси реакции Фентона приводит к формированию продукта способного конкурировать со спиновой ловушкой для OH* - 5,5-диметилпирролин-N-оксидом (DMPO) [16, 216]. Гистидин и гомокарнозин взаимодействовали с OH* менее эффективно, чем карнозин. Образование комплексов OH* с в-аланином и ГАМК обнаружено не было. Интересно отметить, что эффективность связывания OH* в смеси в-аланин+гистидин была ниже, чем в присутствии карнозина, что еще раз подтверждает важную роль внутримолекулярных взаимодействий для антиоксидантного эффекта карнозина [16].
В ряде работ были продемонстрированы способности карнозина взаимодействовать с продуктами ПОЛ, препятствуя распространению окислительного повреждения. Карнозин сдерживал накопление малонового альдегида, образующегося в результате окисления фрагментов саркоплазматического ретикулума, и способствовал сохранению функций мембран [18]. Карнозин также снижал количество пероксильных радикалов, образующихся в липосомах печени в результате инициации ПОЛ с помощью азосоединений [15]. С использованием внеклеточных систем Zhou и Decker наглядно продемонстрировали взаимодействие карнозина с ненасыщенными альдегидами (транс-2-гексеналь, транс-2-ноненаль), а также 4-гидроксиноненалем - опасным продуктом повреждающим ДНК [19, 217]. Гистидин и имидазол также демонстрировали защитное действие, в то время как в-аланин и ГАМК не оказывали какого либо эффекта [15, 19].
Одним из проявлений антиоксидантных свойств карнозина является его радиомодифицирующий эффект. Повреждающее действие ионизирующего излучения связано, главным образом, с развитием мощнейшего окислительного стресса в результате радиолиза воды. Пероральное введение мышам карнозина в течение 20 суток перед облучением способствовало повышению выживаемости животных [218]. Радиомодифицирующее действие карнозина было подтверждено с помощью метода эндогенных селезеночных колоний. Было обнаружено увеличение эффективности образования колоний гематопоэтическими стволовыми клетками из костного мозга мышей, которым перед облучением вводили карнозин, по сравнению с контрольными животными [219, 220].
1.3.3 Эффект карнозина и его производных на пролиферацию нормальных и опухолевых клеток
Продолжительное культивирование нормальных человеческих фибробластов с карнозином (10 - 50 мМ) приводило к удлинению продолжительности жизни клеток, что выражалось в увеличении количества популяционных удвоений, т.н. предела Хейфлика [221]. Кроме того, отмечали задержку развития старческого фенотипа в виде усиления зернистости и потери вытянутой фибробластоподобной формы [22]. Добавление карнозина к клеткам долгое время культивируемым на среде без карнозина приводило к обращению старческого фенотипа и способствовало увеличению продолжительности их жизни в сравнении с контролем. Удаление карнозина из среды нивелировало описанный эффект [222]. Карнозин также способствовал увеличению эффективности посева фибробластов. При посеве клеток в низких разведениях, в чашках инкубируемых с карнозином образовывалось больше колоний, чем в контрольных, что указывает на активацию пролиферативных процессов фибробластов под действием карнозина [222]. Позже Shao et al. продемонстрировали замедление скорости укорачивания теломер и снижение количества дефектов в ДНК теломер под действием карнозина [223]. Укорачивание теломер представляется одним из основных факторов ограничивающий количество клеточных делений [224], замедление этого процесса может быть одним из механизмов удлинения предела Хейфлика и задержки формирования старческого фенотипа с помощью карнозина.
В 1986 году, японские ученые Nagai и Suda впервые описали эффект карнозина на опухолевый клетки, который в корне отличался от действия карнозина на нормальные клетки. Подкожные инъекции карнозина мышам линии ddY, которым предварительно вживляли клетки саркомы, способствовали снижению интенсивности пролиферации опухолевых клеток и увеличивали выживаемость животных [20]. В независимом исследовании Renner et al. на мышах с ксенографами HER2/neu NIH3T3 фибробластов показали, что ежедневные внутрибрюшинные инъекции карнозина существенно подавляют пролиферацию злокачественных клеток и опухолевый рост. Снижение скорости пролиферации опухолевых клеток под действием карнозина сопровождалось снижением синтеза АФК и активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Кроме того, в опухолях мышей, которым делали инъекции карнозина карнозина было обнаружено меньшее количество митозов, чем у контрольных животных [21]. Сходные изменения наблюдали в первичной культуре клеток мультиформной глиобластомы (Glioblastoma multiforme). Обработка клеток карнозином (20-50 мМ) в течение 4 дней приводила к уменьшению внутриклеточного уровня АТФ и ЛДГ, а также к снижению синтеза ДНК [208]. Ингибирование митохондриального дыхания с помощью KCN в клетках обработанных карнозином не влияло на выработку АТФ или выживаемость клеток. Обработка клеток глиобластомы оксаматом - ингибитором ЛДГ - приводила к резкому снижению концентрации АТФ, при этом карнозин приводил к дальнейшему снижению концентрации АТФ. Исходя из полученных данных авторами был сделан вывод о том, что карнозин индуцирует изменения на уровне гликолиза, которые приводят к ингибированию клеточной пролиферации [225]. Holliday и McFarland наглядно продемонстрировали избирательность ингибирующего эффекта карнозина на рост опухолевых клеток [23, 226]. Добавление карнозина к смеси опухолевых клеток (HeLa) и нормальных человеческих фибробластов (MRC-5) приводило к выборочному уничтожению опухолевых HeLa клеток и способствовало удлинению продолжительности жизни фибробластов [23]. Интересно отметить, что действие карнозина на две активно пролиферирующие культуры - эмбриональные стволовые (ЭС) клетки мыши и иммортальные клетки эмбриональной терато-карциномы (ЭК) мыши также было различно. Карнозин препятствовал росту злокачественных ЭК-клеток, не затрагивая роста ЭС-клеток [226]. Полученные данные указывали на то, что ни степень дифференцировки, ни скорость пролиферации клеток не являются определяющими факторами избирательного действия карнозина на опухолевые клетки.
Количественный анализ экспрессии белков в клетках глиобластомы в контроле и после обработки карнозином выявил изменения в экспрессии 31 белка под действием карнозина, в том числе: Von Hippel-Lindau binding protein 1 (VBP1), BCL2-associated athanogene 2 (BAG2), GrpE-like protein chaperone (GrpEL), transaldolase 1 (TALDO), uroporphyrinogen decarboxylase (UROD) и Obg-like ATPase 1 (OLA1) [227]. Интересно отметить, что VBP1, BAG2 и GrpEL участвуют в регуляции активности Hypoxia-inducible factor 1б (HIF-1б) [227-230], а BAG2 и GrpEL вовлечены в регуляцию активности белков теплового шока (Heat shock protein 70, Hsp70) [231]. Оверэкспрессия HIF-1б и Hsp70 часто способствует злокачественной трансформации [232, 233]. Приведенные данные указывают на возможное участие регуляторных каскадов HIF-1б и Hsp70 в антипролиферативном эффекте карнозина.
В нашей лаборатории было показано, что карнозин замедляет рост уровня фосфо-ERK1/2 и JNK в гранулярных клетках мозжечка в условиях окислительного стресса, индуцированного активацией глутаматных рецепторов [234]. Как было отмечено выше ERK1/2 представляет собой редокс-чувствительную МАР-киназу, регулирующую множество внутриклеточных функций, в том числе и пролиферативные процессы. Было показано, что ингибирование образования Н2О2 препятствует активации ERK1/2 и развитию пролиферативного ответа [235]. Таким образом, понижение уровня АФК под действием карнозина представляется одним из механизмов подавления активации ЕRK1/2 [234, 236]. Повышенный уровень ERK1/2 часто встречается при онкологических заболеваниях [105]. Ингибирование роста ERK1/2 может быть одним из механизмов антипролиферативного эффекта карнозина.
Исследование противоопухолевого эффекта производных карнозина (анзерина, гомокарнозина и D-карнозина) выявило, что только анзерин способен ингибировать рост трансформированных клеток. Также было обнаружено, при равных концентрациях (20 мМ) в-аланин не оказывал какого либо влияния на опухолевые клетки, в то время как гистидин убивал все клетки (нормальные и опухолевые) [23]. Полученные данные явно указывают на определяющую роль гистидина в проявлении противоопухолевого эффекта карнозина.
1.3.4 Пинеалон. Общая характеристика и свойства
В настоящее время установлена роль регуляторных короткоцепочечных пептидов в формировании адаптационного ответа организма на стресс и нарушения гомеостаза [237]. Будучи эндогенными компонентами живой клетки, пептидные биорегуляторы обладают разнообразным биологическим действием, они эффективны в низких дозах, не вызывают побочных эффектов [238]. Однако их терапевтическое применение ограничено проницаемостью через гемато-энцефалический барьер (ГЭБ) и относительно быстрой скоростью распада. Преодолеть эти проблемы можно путем синтеза короткоцепочечных аналогов нейропептидов, сохраняющих их специфическую активность [239-243].
Пинеалон представляет собой синтетический трипептид состоящий из трех аминокислот глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и аргинина (Glu-Asp-Arg), синтезированный на основе анализа экстракта коры головного мозга крупного рогатого скота (Рис. 1.6). Последовательность Glu-Asp-Arg была выбрана как наиболее часто встречающаяся в "активных участках" наиболее функционально-значимых в своей группе полипептидов, содержащихся в животных экстрактах.
Пинеалон демонстрирует эффективные антиоксидантные свойства. Пинеалон усиливал устойчивость экспериментальных животных к пренатальной и острой сублетальной гипобарической гипоксии. Введение пинеалона крысам чувствительным к гипоксии усиливало активность антиоксидантных ферментов - СОД и GPx. В культуре гранулярных клеток мозжечка пинеалон снижал уровень АФК и клеточную гибель, индуцированные активацией глутаматных рецепторов NMDA-класса [244, 245]. На модели пренатальной гипергомоцистеинемии было показано, что инъекции пинеалона самкам улучшают когнитивные способности потомства и способствуют развитию устойчивости к окислительному стрессу [246]. Кроме того, пинеалон препятствовал увеличению уровня АФК в гранулярных клетках мозжечка крысы под действием гомоцистеина (ГЦ) и затормаживал активацию ERK1/2 [247]. Недавно были получены данные о возможном участии пинеалона в эпигенетической регуляции. Пинеалон проникал в ядро клетки, а также взаимодействовал с некоторыми промоторными последовательностями, в частности с одноцепочечной oligo(dGC). Интересно, что предпочтительным местом связывания пинеалона была последовательность CNG, которая также является местом метилирования ДНК [248, 249]. Исходя из способностей пинеалона модулировать внутриклеточный уровень АФК и связываться с ДНК можно предположить, что пинеалон также способен участвовать в регуляции пролиферации.
Рисунок 1.6. Химическая структура молекулы пинеалона.
Подводя итог всему выше сказанному, можно заключить, что антипролиферативный эффект карнозина известен давно, однако его молекулярный механизм до сих пор непонятен. Понимание механизма действия карнозина помогло бы расширить область применения природного дипептида карнозин на практике, например в терапии опухолевых заболеваний. На сегодняшний день накоплено множество сведений об участии про- и антиоксидантов в регуляции процессов клеточной пролиферации. Поскольку, карнозин демонстрирует эффективные антиоксидантные свойства, было сделано предположение о том, что ингибирующий эффект карнозина на пролиферацию опухолевых клеток является следствием его антиоксидантной активности. Сравнительный анализ действия карнозина и его производных на пролиферацию опухолевых клеток помог бы определить функциональную нагрузку отдельных частей молекулы при антипролиферативном эффекте и пути улучшения эффективности антипролиферативных свойств карнозина.